山楂中黄酮提取的研究

郭 亮 王谷洪 周 齐 刘旭海 王桂华

（1.深圳市瑞升华科技股份有限公司，广东 深圳518000；2.江中药业股份有限公司，江西 南昌330000）

0 引言

黄酮类化合物在自然界中普遍存在，呈现弱酸性。在双子叶植物的叶、根、茎以及果实中大量存在。而山楂叶所含的活性组分大多为黄酮苷，它们的极性不同，可根据相似相溶原理，用水、丙醇、正丁醇等提取。黄酮类化合物能使心肌的耗氧量减少，在预防动脉硬化方面有良好的作用；同时黄酮化合物还能延缓人体衰老过程，增强人体免疫力，对人体的内分泌系统具有良好的调节作用；而且黄酮还具有防癌的作用，对一些冠状动脉心脏疾病相关的症状有一定的预防作用。因此这些化合物能够广泛应用在医药、保健食品添加剂和杀虫剂等领域，于是在国内外越来越成为人们研究的热点。

PEG 是聚乙二醇英文名polyethylene glycol的简称，无毒、无刺激性，具有良好的水溶性，并与许多有机物组分有良好的相溶性。

1 实验

1.1 仪器、试剂与材料

紫外分光光度计（龙尼柯有限公司）、离心机（北京离心机厂）、恒温水浴锅（上海仪器有限公司）、干燥箱（江苏曙峰企业）、分析天平（莱阳化工有限公司）。

芦丁对照品（批号100080－200707）购自中国食品药品检定研究院，山楂购自国药控股福建有限公司中药部。

所有试剂均为分析纯。

1.2 山楂粗提液的制备

准确称取山楂碎末5g，放到烧杯中，向烧杯中加入60%乙醇120mL，混合5min，然后将溶液转移至250mL 容量瓶中，补加蒸馏水至刻度，摇匀，充分混合，静置4h后，减压过滤得到暗红色的山楂粗提液。

1.3 芦丁标准溶液的配制

用分析天平称取5 mg 芦丁，加60%乙醇溶解，定容到100mL，得到50μg/mL的芦丁标准品溶液。

取6只容量瓶，标号1、2、3、4、5、6号，用移液管移取0mL芦丁标准品加入到1 号容量瓶中，然后加入5% NaNO2溶液0.7mL混合均匀，5min后再加入10%Al（NO3）3溶液0.7mL，混合均匀，过5 min 之后，向混合液中加入5% NaOH 溶液0.7mL，然后用30%乙醇定容，混合均匀。分别向2 号加入1mL、3号加入2mL、4号加入3mL、5号加入4mL、6号加入5mL 芦丁标准品，其他步骤与前面一致，静置10 min左右在512nm 处测定芦丁标准品的吸光值，以1号容量瓶中的溶液作为空白对照，分别测量各组的吸光度，把芦丁标准品浓度作为横坐标，各组得到的吸光度A 作为纵坐标，做出芦丁标准曲线为A＝18.611C＋0.007 7，r＝0.999 1，芦丁浓度在1～6μg/mL范围内，线性关系良好。

1.4 双水相体系的配制

将一定量的聚乙二醇、硫酸铵、3 mL 粗提液，加入一部分蒸馏水，用0.1mol/L的NaOH 和0.1mol/L的HCl调节pH，使双水相系统的总质量为10g。摇匀使两相充分混合，在离心机中离心，使之快速分相，5min后取出。用胶头滴管分别吸取上、下相溶液进行分析，分别测定上、下相体积，双水相中山楂总黄酮的含量。

1.5 山楂中总黄酮含量的测定

取6个试管，标号1、2、3、4、5、6号，向2号管中加入对照液1.0mL、3号管中加入2.0mL、4号管中加入3.0mL、5号管中加入4.0mL、6号管中加入5.0 mL，分别加入50%乙醇使成5mL；精密加入5% NaNO2溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加入10%Al（NO3）3溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加入1mol/L NaOH 溶液4mL；用50%乙醇加到10mL处，混合均匀。

向1 号管中加入5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6min；加入10% Al（NO3）3溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加入1mol/L NaOH 溶液4mL；用50%乙醇定容到10mL处，混合均匀，作为对照溶液，在512nm 波长处测定待测液的吸光度，代入标准方程，分析计算样品中总黄酮的含量。

2 结果与分析

2.1 PEG/（NH4）2SO4双水相体系相图

将用浊点法计算出来的PEG800、1000、2000 的质量浓度和（NH4）2SO4质量浓度在一个坐标系中作出相图，得到PEG的平均分子量不同，相图中双接线位置与形状也不同，PEG 分子量增大，曲线越接近坐标轴。

2.2 PEG 平均分子量对双水相体系的影响

以相图为依据，选择质量浓度20%的PEG800和质量浓度20%的（NH4）2SO4混合，分析计算山楂中黄酮的分配系数K 和萃取率，然后继续改变PEG 的分子量，使硫酸铵的质量浓度不变，分别测定在PEG1000和PEG2000的情况下黄酮的萃取结果，实验结果如表1所示。从表1可以看出，黄酮在双水相中的分配系数和萃取率和PEG 的变化成反比，这可能是因为当PEG 分子量变大时，上、下两相界面间的张力变大，从而影响了传质效率，导致分配系数和萃取率减小。PEG 平均分子量越低，水溶性越好，K 值和萃取率在PEG800 时达到最大。根据相似相溶原理，山楂中可能含亲水性的黄酮类化合物较多，所意选择PEG800较好。

表1 PEG 平均分子量对双水相体系的影响

考虑成相的条件，由于靠近临界点位置的系统不容易形成两相系统，而距离临界点位置较远的系统，PEG 的质量分数比较大，黏度比较大，两相分离的时间比较长，因此选择PEG 和（NH4）2SO4的质量分数要适中，既要使双水相系统的形成时间尽可能缩短，同时又不会有晶体析出。

2.3 PEG800的质量分数对双水相体系的影响

选择不同质量分数的PEG800 和质量分数为20% 的（NH4）2SO4分别组成双水相体系，分析山楂中总黄酮的分配系数和萃取率（表2）。

表2 PEG800的质量分数对双水相体系的影响

从表2可以看出，随着PEG800质量分数增大，相比R、分配系数K 和萃取率Y 也在升高，在PEG800 的质量分数为25%时，达到最大，所以PEG800的合适质量分数为25%。

2.4 （NH4）2SO4的质量分数对双水相体系的影响

选择不同质量浓度的（NH4）2SO4和质量分数为25%的PEG800组成双水相体系，分别分析计算山楂中黄酮的分配系数K 和萃取率Y（表3）。

表3 （NH4）2SO4的质量分数对双水相体系的影响

从表3中可以看出，（NH4）2SO4质量浓度越大，相比R 值越小，制作相图可以得到萃取率Y 和分配系数随（NH4）2SO4质量浓度的变化不一致，分配系数先增大，达到一个极值点然后下降，而黄酮的萃取率却一直在减小。因而选择质量浓度为12%的（NH4）2SO4。

2.5 影响山楂中黄酮萃取的因素

2.5.1 pH 的影响

将质量分数为25%的PEG800 和质量分数为12%的（NH4）2SO4作为双水相体系，用盐酸和氢氧化钠调节pH 值，得到结论在pH＝9时，分配系数和萃取率最大，为最佳pH。

2.5.2 样品加入量的影响

在25%PEG800和12%（NH4）2SO4、pH＝9时，加入不同体积的粗提液进行实验，结果得出，当粗体液的体积超过3mL时分配系数K 和萃取率Y 都下降，萃取率在3 mL 时达到最高，因此确定粗提液体积最佳值为3mL。

3 结语

经过实验，萃取分离山楂中总黄酮的最佳双水相体系条件是25%PEG800和12%（NH4）2SO4，样品加入量3mL，pH＝9。在此条件下，黄酮的萃取率能达到95%以上。因此，实验中采用PEG/（NH4）2SO4双水相体系萃取分离山楂中总黄酮的方法是可行的，可以作为黄酮类化合物萃取分离的一种有效方法。