茯苓最佳炮制工艺的综合评分法研究

王海燕 杨俊杰 梁利香

（信阳农林学院生物与制药工程学院，河南信阳464000）

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria Cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾、宁心之功效，可用于水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安、惊悸失眠[1]。茯苓为常用中药，是多种方药及中成药的原料，有“十药九茯苓”之说。茯苓中主要含有茯苓聚糖、三萜、树胶、蛋白质以及脂肪酸等[2]。《中国药典》[1]（2010 年版一部）茯苓项下收载的加工方法为：“挖出后除去泥沙，堆置‘发汗’后，摊开晾至表面干燥，再‘发汗’，反复数次至现皱纹，内部水分大部散失后，阴干”；炮制方法为：“取茯苓个，浸泡，洗净，润后稍蒸，及时削去外皮，切制成块或切厚片，晒干”。此方法加工生产流程繁琐，影响有效成分含量，“阴干”后再“浸泡”、“润蒸”，造成能源浪费。故我们在调查了多个茯苓产地和加工企业的加工方法后，将其生产工艺简化为：发汗→去皮→切制→干燥，并采用正交试验设计法，首次以茯苓酸和茯苓多糖的综合作用为指标，对茯苓的炮制方法进行研究，以期为茯苓饮片的生产提供技术指导。

1 材料、试剂和仪器

1.1 材料与试剂 茯苓药材购于信阳市药材站，经信阳农林学院周巍教授鉴定为Poria Cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核；茯苓酸对照品为本实验室自制，经面积归一化法测定其纯度大于98%；D-无水葡萄糖对照品由中国药品生物制品检验所提供，供含量测定用，批号110833-200503；纯化水自制；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器 L600-DP6高效液相色谱仪 （北京普析

通用仪器有限责任公司）；TU-1810紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；梅特勒AB135-S电子分析天平（上海树信仪器仪表有限公司）；SCQ-8201E超声清洗仪（上海声彦超声波仪器设备有限公司）；水循环恒温水浴箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；微型提取罐（上海雅程实验设备有限公司）；60-A多功能中药切片机（潍坊市北方制药设备制造有限公司）。

2 方法与结果

2.1 茯苓酸的含量测定 参考文献[3]的方法。

2.1.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2%甲酸水溶液（80∶20）为流动相；检测波长为242nm。

2.1.2 对照品溶液的制备 取茯苓酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取茯苓粉末（过60目筛）约0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加甲醇25mL，称定，浸泡25min，超声90min，放置，称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，弃初滤液，准确量取续滤液5mL，置于蒸发皿中，水浴蒸干，残留物用甲醇定容至2mL容量瓶中，即得。

2.1.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液10μL与供试品溶液5～10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2 茯苓多糖的含量测定 参考文献[4]的方法。

2.2.1 粗多糖的提取与精制 称取茯苓药材20g，加水煎煮提取2次，合并提取液，提取液以纱布滤过，放冷，离心 5min（2000r/min），分取上清液，滤液加乙醇使含醇量达80%，静置过夜。过滤，残渣先后用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，于60℃减压干燥，即得。

2.2.2 多糖的含量测定

2.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖103mg，置100mL量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，即得。

2.2.2.2 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL， 分别置 25mL 刻度试管中，加入5%苯酚溶液1.00mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.00mL，加水至总体积10mL，摇匀，静置 5min，置沸水浴中加热15min，再置冷水浴中10min，补充失去的水分至刻度。以2mL蒸馏水同法操作作为空白对照，在490nm处，测吸光度，以葡萄糖浓度对吸收度进行线性回归，得回归方程：A=0.0693C+0.0009（r=0.9992）。 试验结果表明，多糖含量以葡萄糖计在20.6～61.8μg/mL与吸收度线性关系良好。

2.2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取多糖10.0mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作贮备液。

2.2.2.4 含量测定 精密吸取贮备液2mL，按“2.2.2.2”项下方法测定吸收度，从回归方程中求出供试液中葡萄糖的浓度，再根据粗多糖的提取、精制和供试品溶液的制备方法，计算样品中茯苓多糖以葡萄糖计的含量。

2.3 炮制工艺的正交试验设计

2.3.1 因素-水平表 根据简化的炮制方法，以茯苓酸、茯苓多糖含量为指标，以L9（34）正交表进行设计，对发汗次数、饮片规格和烘干温度进行考察。因素-水平见表1。

表1 因素-水平表

2.3.2 正交试验结果 见表2。对正交设计实验结果进行直观分析，可知各因素影响的主次顺序为：发汗次数＞烘干温度＞饮片规格。在考察范围内，炮制工艺的最佳条件可选择为：A3B2C2。表3为方差分析结果，由F值可知发汗次数有极显著性影响，烘干温度有显著性影响。结合实际，确定炮制方法为：趁鲜，去皮，切制成厚片或丁，70℃烘干。

表2 正交设计试验结果

表3 方差分析表

2.4 对照实验 按照《中国药典》（2010年版一部）茯苓加工方法和本实验确定的加工方法对茯苓药材进行处理，并分别测定茯苓酸和茯苓多糖的含量（n=3），结果见表4。从表4可见，按实验方法中测得的茯苓酸、茯苓多糖分别是药典方法的136.70%、146.92%。

表4 对照实验考察结果

3 讨论

到目前为止，关于茯苓炮制工艺的研究并不多。许腊英等[5]曾以茯苓多糖为指标对茯苓炮制工艺进行研究。本研究首次以茯苓酸和茯苓多糖的综合作用对加工方法进行考察，填补这方面的空白。《中国药典》[1]（2010年版一部）茯苓质量标准项下收载以稀乙醇为溶剂，测定茯苓醇溶性浸出物，考虑到临床中药茯苓入中成药的应用因素，是否应增加醇溶性浸出物为指标，有待进一步考察。

“发汗”是中药材传统加工处理方法之一，是将药材采收后堆置，使其中水分溢出的方法。发汗法操作耗时长，无量化指标，多凭经验判断。现今社会对中药饮片炮制品的生产要求规模化、自动化，对生产的各过程均要严格控制。发汗法能否有合适的现代干燥方法替代，有待进一步研究。

在多指标的优化实验中，综合指标的计算需对各个指标进行综合考虑和权衡，因茯苓酸和茯苓多糖的重要性一样，故在综合评分法中各占50%。如果茯苓饮片的干燥温度过高，不仅会影响饮片中茯苓酸和茯苓多糖含量，而且会使饮片颜色加深，影响外观性状。

本研究确定的茯苓加工方法，操作简单，茯苓饮片质量重现性好，可为国家有关部门制定茯苓饮片炮制品标准提供可靠依据。

[1] 国家药典委员会.中国药典（一部）.北京：人民卫生出版社，2010：224

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（上册）.上海：上海科学技术出版社，1999：554

[3] 昝俊峰，徐斌，於小波，等.全国20个主要产地茯苓质量分析比较研究.中国中医药信息杂志，2010，17（8）：34

[4] 李俊艳，魏学军，石朝珊，等.茯苓皮与茯苓块中多糖的含量测定.黔南民族医专学报，2009，22（4）：243

[5] 许腊英，付文强，万芳，等.茯苓炮制工艺的研究.湖南中医学院学报，2007，9（1）：44