2种复方制剂对中华鳖非特异性免疫功能的作用效果

周冬仁，罗毅志，叶雪平，潘晓艺，陈建明，沈斌乾

（浙江省淡水水产研究所，浙江 湖州313001）

中华鳖分布于中国、日本、越南北部、韩国、泰国等，浙江地区中华鳖养殖主要以日本品系及太湖品系为主。中华鳖生长缓慢，抗病力强，对自然生活环境要求较高。在人工养殖条件下，受到高密度、水质恶化、温室等条件的影响，鳖抗病力下降，病害严重。目前，腮腺炎、白底板、胃穿孔、红底板等疾病在中华鳖生产中较为常见［1］。养殖户高频度、高剂量使用各类化学药物和抗生素，使病害得到一定程度的扼制，但对养殖环境和水产品质量安全造成了负面影响，不利于中华鳖养殖业的可持续发展。因此，在探索治疗手段的同时，提高中华鳖自身的免疫力和抗病力，也是解决中华鳖病害防控的有效途径之一。

中华鳖属于低等爬行纲动物，没有完善的免疫系统，非特异性免疫在系统发育上比特异性免疫早，与高等脊椎动物相比，中华鳖在防御疾病时更依赖于非特异性免疫。中华鳖的非特异性免疫功能不仅是防御疾病的第一道屏障，更在整个免疫系统中起着至关重要的作用［2］。目前，用于水产养殖的免疫增强剂有甘草多糖、酵母细胞壁、脂多糖、黄芪多糖、穿心莲提取物、半胱胺等。中草药提取物及多糖能增强水产动物的非特异性免疫功能，作为免疫增强剂目前已广泛应用于水产养殖［3］。覃川杰等［4］研究表明，茯苓多糖对中华鳖的非特异性免疫功能有增强作用。孟兆娜等［5］研究表明，复方中药添加剂可以增强镜鲤血清转氨酶及红细胞抗氧化酶活性。施伟达等［6］研究表明，植物免疫增强剂对中华鳖肝脏SOD和CAT 酶活性的改善有明显作用。为评价芪草多糖、金莲免疫散复方制剂对中华鳖非特异性免疫功能的影响，笔者于2013年年末在湖州中湖农业开发有限公司进行了2种复方制剂对中华鳖几种非特异性免疫功能的影响试验，以期为中草药复方制剂在中华鳖养殖上的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 中华鳖及饲养池

试验中华鳖为孵出的同一批稚鳖。在同一个温室大棚内随机选取9个条件相同的饲养池，每池放养1 000只。每个饲养池面积25m2，池深1．2m，池底呈圆锅底状，中间为排污口，水深0．7 m，中央设8m2的石棉瓦投食台。

1．2 中草药免疫制剂

芪草多糖：以黄芪多糖、甘草多糖、金银花为主要原料配制。金莲免疫散：以金银花、穿心莲、大青叶和虎杖等的提取物为主要原料配制。将原料70℃烘干12h，粉碎至80目，按配方比例配制后混匀，由浙江省淡水水产研究所生物制剂厂提供。

1．3 饲养管理

随机将9个饲养池分为3组，对照组：饲喂商品稚鳖饲料（CP47）；芪草多糖组：饲喂商品稚鳖饲料＋芪草多糖2g／kg；金莲免疫散组：饲喂商品稚鳖饲料＋金莲免疫散2g／kg。中华鳖放养后，先用商品稚鳖饲料驯食3 周后正式试验，试验期60d。投喂饲料均为现用现配的软颗粒，开始时粒径为1．5mm，30d后粒径为2mm。每天喂食2次，试验初期投饲率约为体重的6%，30d后降为4%。试验期间，每周从中间排污口少量排出污水，并加注新水，换水约10%。水温控制在31℃左右。

1．4 血清采集及指标测定

试验61d时每池随机捞取中华鳖3只，用丁香酚麻醉后擦干体表水分，用止血钳拉住头部，手术剪剪开颈部血管，采取血液储存于采血管内，于37℃放置2h，待血清完全析出后置于4℃冰箱中备用。

血清超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性：采用黄嘌呤氧化酶法测定。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）和碱性磷酸酶（AKP）活性：用试剂盒（南京建成生物技术研究所）测定。溶菌酶（Lysozyme）活性：溶菌酶标准品购于SIGMA 公司，用0．1 mol／L PBS 将微球菌（南京建成生物技术研究所）配制成0．2mg／mL 菌悬液，每个样品取血清0．05mL加入到3．0mL 菌悬液中混匀，立即在550nm 下测定A0值；然后在28℃水浴中温育30min，置于4℃冰浴8 min 终止反应，再测定550nm下的A 值计算溶菌酶活性。

溶菌酶活性＝（A0－A）／A。

1．5 抗菌力测定

腹腔注射嗜水气单胞菌菌液浓度为1×109cfu／mL，每只中华鳖注射剂量为0．1 mL，放养于同样规格的缸中，每天观察死亡情况，观察15d，统计死亡率，计算攻毒存活率。每个平行试验做3组，每组15只。

攻毒存活率＝（1－死亡数／总数）×100%。

1．6 数据统计分析

试验数据以均值±标准误（Mean±SE）表示。用SPSS11．5 软 件 进 行 单 因 子 方 差 分 析（One－way ANOVA），检验不同组间各指标是否存在显著性差异，若有显著差异（P＜0．05），则作Duncan 氏多重比较。

2 结果与分析

2．1非特异性免疫酶的活性

从表1看出，中华鳖的碱性磷酸酶活性金莲免疫散组为8．44 U／mL，显著高于对照组；芪草多糖组为7．79U／mL，与对照组和金莲免疫散组间差异均不显著。超氧化物歧化酶活性金莲免疫散组、芪草多糖组分别为112．88 U／mL 和116．54 U／mL，均显著高于对照组，金莲免疫散组与芪草多糖组间差异不显著。谷胱甘肽过氧化物酶活性各组间差异不显著。溶菌酶活性金莲免疫散组、芪草多糖组均为0．85IU／mL，均显著高于对照组，金莲免疫散组与芪草多糖组间差异不显著。

表1 试验各组中华鳖非特异性免疫酶的活性Table 1 Effect of two compound preparations on nonspecific immune enzyme activity of T．Sinensis

表2 试验各组中华鳖攻毒15d内的存活率Table 2 Survival rate of different treatments within 15dof T．Sinensis

2．2 抗菌力

从表2看出，金莲免疫散组中华鳖15d内的平均存活率为71．11%，芪草多糖组为68．89%，对照组为55．33%，金莲免疫散组、芪草多糖组分别比对照组高15．78百分点和13．56百分点，但各组间差异不显著。

3 结论与讨论

1）超氧化物歧化酶（SOD）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，是反映动物机体非特异性免疫功能的重要生理指标。超氧化物歧化酶广泛存在于生物体内，是一切需氧有机体清除超氧阴离子自由基、保护机体免受伤害的一种关键金属酶，其活性与动物的免疫水平密切相关，是重要的抗氧化酶之一［7］。试验结果表明，在饲料中添加复方中草药制剂后，中华鳖血清中超氧化物歧化酶活性显著高于对照组（P＜0．05），但金莲免疫散组和芪草多糖组间差异不显著（P＞0．05）。

2）溶菌酶（Lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N－乙 酰 胞 壁 质 聚 糖 水 解 酶（N－acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶［8］。主要通过破坏细胞壁，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活［9］。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，测定中华鳖的溶菌酶活性，可以在一定程度上反映其非特异性体液免疫状态。试验结果表明，饲料中添加复方制剂金莲免疫散、芪草多糖能显著（P＜0．05）提高溶菌酶的活性。

3）谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）是机体内广泛存在的一种过氧化物分解酶。赵燕等［10］研究表明，口服半胱胺能提高中华鳖谷胱甘肽过氧化物酶的活性。王宏芳等［11］研究表明，松茸多糖能提高小鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶的活性。试验结果表明，金莲免疫散和芪草多糖复方制剂对中华鳖谷胱甘肽过氧化物酶活性无显著影响，具体原因有待于进一步试验证实。

4）碱性磷酸酶（AKP）是一组同功酶，可作为判断水产动物免疫能力的参考指标。试验结果表明，金莲免疫散能显著提高中华鳖的碱性磷酸酶活性，芪草多糖也能提高其活性。与刘岩等［12］用甘露糖醛酸多糖注射对虾，王明华等［13］用中草药煎液投喂日本沼虾的结果一致。表明，金莲免疫散、芪草多糖对中华鳖具有免疫增强作用。

5）试验结果表明，金莲免疫散组、芪草多糖组的攻毒存活率分别比对照组高15．78 百分点和13．56百分点，证明金莲免疫散、芪草多糖制剂能提高中华鳖的非特异性免疫功能。

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［2］ 龙 华．水生动物10种非特异性免疫因子的研究进展［J］．长江大学学报：自然科学版，2005，11（2）：67－72．

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