益气养阴利水剂对脾气虚型视网膜脱离复位后抗凋亡及抗氧化作用的实验研究*

张妍春，雷春灵，杨新光，毕春潮，孙娟玲，郭 艳，朱赛林，李亚芙

(1．西安市第四医院，西安 710004;2．陕西中医学院，陕西咸阳 712000)

益气养阴利水剂对脾气虚型视网膜脱离复位后抗凋亡及抗氧化作用的实验研究*

张妍春1，雷春灵1，杨新光1，毕春潮1，孙娟玲1，郭 艳2，朱赛林1，李亚芙1

(1．西安市第四医院，西安 710004;2．陕西中医学院，陕西咸阳 712000)

目的:观察益视汤对脾气虚型兔RD自动复位后细胞凋亡及机体氧化应激状态的影响。方法:实验兔按随机数字表法分为正常对照组(A)、RD自动复位组(B)、脾气虚型RD自动复位组(C)及益视汤治疗组(D)，分别于RD自动复位模型制备后10 d、20 d、30 d随机处死取材，采用透射电镜及TUNEL染色观察视网膜各层细胞凋亡的发生，取血清行SOD、MDA测定。结果:电镜下可见B、C、D组视网膜内外核层出现凋亡特征性形态改变细胞及TUNEL染色阳性细胞，比较细胞凋亡指数，C组较B组明显升高;D组较C组显著下降。与A、B组比较，C组血清SOD活性明显降低，MDA值明显升高，D组较C组SOD活性显著升高，MDA降低。结论:脾气虚证加重机体氧化损伤及RD自动复位后细胞凋亡的发生，使用益视汤能够提高机体的抗氧化能力，降低细胞凋亡的发生。

脾气虚证;视网膜脱离;益气养阴利水;细胞凋亡;氧化应激;益视汤

视网膜脱离(retinal detachment，RD)是严重的致盲性眼病，随着RD手术复位率的不断提高［1-3］，术后大多数患者即使视网膜解剖复位良好但视功能改善不理想，长期随访RD涉及黄斑的患者术后视力多年多数仅维持在0.2～0.4之间［4-6］，目前临床缺乏有效的药物促进患者术后视功能的恢复，由此带来的问题尤显突出。除神经胶质瘢痕形成等视网膜结构破坏外，感光细胞的凋亡是RD患者视力丧失的主要原因［7-9］。近年来的研究已证实，活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及由此产生的氧化应激在细胞凋亡中发挥着关键作用［10］。许多诱导凋亡发生的因子本身就是氧化剂或者是刺激细胞发生氧化代谢的因子，而大量凋亡抑制剂能够抗氧化或提高细胞抗氧化能力［11］。

多年来，中医药临床广泛用于RD的辅助治疗。脾气虚证与RD关系密切，患者气虚不固导致视网膜神经上皮层与色素上皮层间分离，脾虚失运致视网膜下液蓄积且吸收困难，久病伤阴进一步加重视功能损伤。根据这一病理机制，我们制定了以补益脾气为主、利水养阴为辅的中药复方制剂“益视汤”，促进RD复位手术后视网膜下液的吸收及视功能的恢复，取得了肯定的效果。

脾胃为后天之本，生化之源，细胞内ATP合成不足是脾气虚证发生的内在机制之一［12］。线粒体是细胞内合成ATP的主要场所，前期实验观察到与单纯RD自动复位组比较，脾气虚型RD自动复位后，光感受器内节、神经节细胞等部位均有显著的线粒体肿胀、嵴减少甚至消失、膜破损或变性溶解形成空白区的表现［13-14］，同时脾气虚证能加重细胞核固缩和粗面内质网扩张;使用益视汤能够明显减轻线粒体的损伤及细胞核固缩现象［15-16］。在病理情况下，线粒体是内源性ROS产生的主要场所［17-18］，视网膜有大量的线粒体，是需要高有氧代谢的组织。由此我们推测，脾气虚证加重视网膜脱离复位后线粒体损伤，致ATP合成不足及氧化损伤，加重视网膜神经细胞凋亡的发生，进而影响视功能的恢复，益视汤能改善脾气虚型RD机体的抗氧化能力，降低RD复位后细胞凋亡的发生。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康成年清洁级新西兰灰兔40只，体质量2000 g～2500 g，雌雄不拘，经裂隙灯、直接检眼镜检查眼前节及眼底均无异常，实验动物及实验室均由第四军医大学动物实验中心提供。将40只实验兔按随机数字表法分为A组正常对照组(4只)、B组RD自动复位组(12只)、C组脾气虚型RD自动复位组(12只)、D组益视汤治疗组(12只)4组，在制备RD自动复位模型后按先前的方法每日灌服益视汤［16］。B、C、D组分别在实验开始时建立RD自动复位模型，手术前、手术后10 d、20 d、30 d各组抽取静脉血，在手术后10 d、20 d、30 d随机处死4只取材进行检查。

1.2 造模方法

1.2.1 脾气虚动物模型的制备 与先前的实验相同，使用耗气破气加饥饱失常方法制备脾气虚证动物模型［14］。于实验开始后将厚朴三物汤煎剂经胃管灌喂C、D组兔，每2 d灌胃1次，用药量12 g/kg体质量，喂药当日禁食，次日喂饲不限量;A、B组同时给予等体积生理盐水灌胃，正常饮食及饮水量，共持续42 d造模。

1.2.2 RD自动复位动物模型的制备 使用先前的方法在视网膜下注射透明质酸钠，于脾气虚证模型造模开始后第22天制备RD自动复位模型［14］。术前对B、C、D组兔用0.5%复方托品酰胺眼水(日本参天株式会社)散瞳，5号球后针自颞上方角巩缘后3mm处刺穿巩膜进入玻璃体，放置中斜角膜接触镜，鼻下方视网膜近赤道部造1～2PD裂孔后向视网膜下缓慢推注透明质酸钠，使后极部视网膜灰白色隆起范围逐渐扩大。

1.3 观察指标及测试方法

1.3.1 宏观指标及血清D-木糖检测 清晨未喂食前检查各组实验兔的精神、活动度、舌象、体质量、肛温，每周1次，每7 d总食量平均后记为各组实验兔每天食量。分别在手术前、手术后10、20、30 d清晨将10%D-木糖按0.5 g/kg给各组兔灌胃，2 h后自耳源静脉抽取静脉血约3 ml，3500 rpm离心10 min后制备血清，采用间苯三酚法测定血清D-木糖(南京建成生物工程研究所D-木糖测定试剂盒，具体操作方法遵照说明书进行)。计算方法:血清D－木糖值(mmol/L)=标准浓度×(测定管OD值－测定空白OD值)/(标准管OD值－试剂空白管OD值)×样品稀释比例。

1.3.2 眼底检查 术后每天使用直接检眼镜、眼部B超、光学相干断层扫描(OCT)观察眼底至视网膜自动复位，记录RD的范围、裂孔大小、自动复位时间、视网膜出血情况和玻璃体反应等情况。

1.3.3 血清T-SOD和MDA检测 分别在实验开始、手术前、手术后10 d、20 d、30 d抽取静脉血离心制备血清，采用黄嘌呤氧化酶法检测血清总超氧化物歧化酶(SOD)，采用硫代巴比妥(TBA)法测定血清丙二醛(MDA)。测试盒购于南京建成生物工程研究所，具体操作依照说明书要求，722分光光度计分别在550 nm、532 nm处、1 cm光径测各管吸光度值。

1.3.4 电镜样品及TUNEL染色标本制作与观察 A组在实验结束时，B、C、D组在手术后10 d、20 d、30 d，耳缘静脉注射过量的3%戊巴比妥钠分批处死实验兔，即刻摘取眼球，快速全周剪除角膜，将左眼置于2.5%戊二醛固定液中，右眼置于4%多聚甲醛中，4℃固定24 h，按先前的方法制备透射电镜超薄切片，使用日本日立H-600透射式电子显微镜进行观察拍照［14］;右眼切取颞下方发生过RD并已复位区域的视网膜组织，按原位细胞死亡检测试剂盒(北京中山生物技术有限公司)说明进行操作。具体为:常规冰冻视网膜组织，用切片机连续切成厚4 μm切片3张，分别贴于载玻片上，PBS洗片，0.3%H2O2甲醇室温孵育30 min，PBS洗片，0.1% TritonX-100冰浴中孵育2 min，PBS冲洗，滴加50 μlTUNEL反应混合液，在湿盒中37℃孵育60 min，PBS冲洗3次;加入50 μl转化剂-POD在湿盒中37℃孵育 30 min，PBS冲洗 3次;加入 50～100 μlDAB底物，室温孵育10 min，PBS冲洗3次;苏木素复染，PBS冲洗3次，树胶加盖片封固;阴性对照:冰冻切片通透后加入50 μl标记溶液以代替TUNEL反应混合物，其余步骤同前。BX-50 OLYMPUS光学显微镜及照相系统下分析结果并拍照。以细胞核内出现棕黄色颗粒者为TUNEL阳性标记细胞。高倍镜下(×40)对每张切片取5个视野，每组共20个视野，分别计数凋亡阳性细胞及细胞总数，其中外核层细胞数目较多，使用0.5网形目镜尺(5 mm×5 mm，各分为10等份，上海第三光学仪器厂)，分别记数2.5 mm2范围内细胞数，以凋亡指数(Apoptosis Index，A I)反映视网膜细胞凋亡的情况，A I=(记数范围内凋亡细胞个数/所有细胞个数)×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，经正态性检验后，多组间比较采用多因素方差分析，所有实验数据以均数±标准差(±s)表示，P＜0.05、P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宏观指标及血清D-木糖检测结果

实验开始后1周，C、D组兔出现精神萎靡、蜷缩嗜卧、纳食减少、稀软便、毛色枯黄等脾气虚证一般症状体征，10 d后出现耳尾色白、体温升高、舌质淡嫩、少苔等表现。停止脾气虚造模因素后观察到，该组兔软便持续存在、毛色灰白、精神倦怠等脾气虚证一般症状体征持续至实验结束。各组实验开始体质量均数(2.2±0.13)至(2.27±0.16)之间，差异无统计学意义(P＞0.05);实验过程中，A、B组不同时间点体质量比较差异无统计学意义、A、B组间体质量比较差异无统计学意义(P＞0.05);术前及术后10 d、20 d、30 d C组及D组体质量明显降低，与A、B组比较差距显著(P＜0.01);随时间延长D组体质量有所恢复，至术后20 d、30 d与C组比较明显升高(P＜0.05)，但仍与B组差异有统计学意义(P＜0.01)。实验开始时，各组间血清D-木糖值比较差异无统计学意义，实验过程中A、B组不同时间点血清D-木糖值比较差异无统计学意义，术前C、D组兔血清D-木糖值较A、B组明显降低，术后C组兔仍维持在较低水平，停止造脾气虚模型因素干预后稍有恢复，但仍显著低于A、B组(P＜0.001);D组兔灌服益视汤后血清D-木糖值缓慢升高，至术后30 d接近正常对照组(P＞0.05)。图1显示，各实验组不同时期体质量及血清D-木糖值变化。

图1 不同时间各组平均体质量(kg)及血清D-木糖水平(mmol/l)

2.2 眼部检查情况

术时在显微镜下均可见视盘下方视网膜灰白色隆起范围达50%～60%。术后裂隙灯下观察，所有眼角膜透明，前房无异常反应，晶状体透明，2只眼玻璃体内可见少量絮状混浊。直接检眼镜观察示，术后早期鼻下方近赤道部约1～2PD裂孔，随复位时间延长视网膜脱离范围逐渐缩小并自行复位，裂孔处瘢痕灶形成;B超、OCT检查示，术后神经上皮层与色素上皮层间发生浆液性脱离(见图2)，视网膜下液量随术后时间延长逐渐减少并完全吸收。其中B、C、D组兔RD分别维持(7.38±2.55)d、(7.54 ±2.21)d、(7.26±2.23)d，经方差分析各组自动复位时间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

图2 B超及OCT检查

图3 各组不同时间血清SOD活性、MDA水平比较

2.3 血清SOD和MDA检测结果

图3显示，实验开始时检查见各组血清SOD活性及MDA值比较差异无统计学意义，RD对照组与正常对照组各时间点比较差异无统计学意义;术前C、D组与A、B组比较，SOD活性差异无统计学意义(P＞0.05)，MDA值明显升高(P＜0.01);术后20 d、30 d C组比较，A、B组SOD活性明显下降(P＜0.01)，MDA值明显升高(P＜0.05)，D组较C组SOD活性明显升高(P＜0.05)，MDA值降低(P＜0.001)。

2.4 凋亡细胞观察

2.4.1 透射电镜观察 图4显示，透射电镜下，正常对照组视网膜视细胞、双极细胞、神经节细胞核内染色质分布均匀，核仁明显，细胞质内线粒体、粗面内质网、核糖体及高尔基体等结构清晰;B、C、D组视网膜内核层、外核层均可观察到有散在细胞体积变小、胞质密度增高、核染色质致密固缩，且出现形状不一、大小不等的团块散布于核内或边集于核膜下，有的核染色质致密凝聚成块，占据整个核区并出现核周空泡，而核膜、质膜和细胞器保存完好。

2.4.2 TUNEL染色结果 图5显示，观察见正常对照组很少有被标记的细胞，阴性对照组无被标记细胞，B、C、D组均可见细胞核被标记为黄棕色的细胞分散分布于内外核层，细胞核被环形或均匀一致着色，周围未见明显炎症反应。

分别计算B、C、D组术后各层凋亡指数均值可以发现，外、内核层凋亡指数明显高于节细胞层(P＜0.001)，B、C组内外核层凋亡指数比较差异无统计学意义，D组内核层凋亡指数较外核层明显下降(P＜0.001)(图6-A);比较术后不同时间各组差异发现，术后10 dC组外核层、内核层及节细胞层细胞凋亡指数均较B组升高(P＜0.05)。结果表明，脾气虚证增加了RD复位后早期各层视网膜的凋亡细胞比例，至20 d、30 d时镜下计数单位面积凋亡细胞数值及总细胞数量均明显高于RD对照组(P＜0.01)，凋亡指数与RD对照组比较差异无统计学意义。分析B组单位面积细胞总数较A组增多与Müller细胞异常增生有关，具体原因有待进一步研究。经益视汤治疗后凋亡细胞发生率明显下降，早期内外核层及节细胞层细胞凋亡指数D组较C组均明显下降(P＜0.05)，术后20 d、30 d内核层及节细胞层D组较C组凋亡指数明显降低(P＜0.05) (图6-B、C、D)。提示益视汤可以减慢但并未阻止视网膜脱离复位后细胞凋亡的发生，尤其随病程延长对内核层及节细胞层的保护作用明显。

图4 透射电镜下观察内核层细胞出现细胞凋亡特征性改变(Bar=4 μm)

3 讨论

本实验使用耗气破气加饥饱失常的多因素复合应用制备脾气虚证动物模型［19］，其造模时间相对较长，同时模型表现较为稳定。在实验过程中观察到，脾气虚证一般宏观症状体征在造模干预后1周就开始有所表现，术前监测制备脾气虚证模型组体质量及血清D-木糖值均明显下降，低于对照组，停止脾气虚模型造模干预因素后，脾气虚组兔以上表现仍然持续存在直至实验结束;在此基础上采用视网膜下直接注射透明质酸钠［20］造成视网膜脱离，经4～10 d后视网膜全部自行复位，避免了其他复位干预因素对实验结果的影响。

图5 术后30 d光镜下视网膜冰冻切片TUNEL染色(40x)

图6 各组视网膜三级神经元细胞层细胞凋亡指数比较

哺乳动物细胞的存活依赖于氧化和抗氧化之间的动态平衡。在生理情况下，内源性活性氧在线粒体内发生的电子传递反应中产生，被细胞防御体系(包括非酶类及酶类，前者如左旋维生素C、维生素E、谷胱甘肽，后者如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶等)清除。但是在特殊的病理情况下，活性氧生成和清除的动态平衡被破坏，导致细胞内ROS水平升高，引起细胞的氧化损伤甚至导致细胞死亡［21］。实验中观察到，脾气虚组血清MDA升高明显，表明脾气虚证这一病理状态加重了机体的脂质过氧化损伤。血清SOD在术后10 d仍保持在较高水平，到术后20 d明显降低。这可能是由于造模前期干预时间较短，兔机体自我调节能力尚存，通过提高自身的抗氧化能力来清除累积的ROS，但处于失代偿状态，随着造模时间的延长，机体抗氧化防御系统出现缺陷，组织氧化-抗氧化平衡进一步失调，致细胞发生氧化应激。

过多的ROS会损伤细胞大分子，并参与不同的细胞凋亡通路，如已经明确的诱导线粒体通透性转变、释放线粒体死亡放大因子、激活细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶以及破坏DNA等［22］导致细胞凋亡发生。文献报道，视网膜脱离后感光细胞发生凋亡是视网膜脱离后发生不可逆视功能损伤的重要原因［7-8］。本实验观察到，细胞核固缩现象在视网膜脱离发生后外核层和内核层均有典型表现。TUNEL染色显示，被标记的细胞呈分散分布于内外核层及节细胞层，细胞核被环形或均匀一致着色，反映了凋亡过程中核染色质先向核边缘迁移、而后向中央集中的特点;同时发现被TUNEL标记的感光细胞周围缺乏炎症反应，从另一个侧面支持视网膜细胞的主要死亡形式是凋亡。以上结果证实，RD复位后视网膜视细胞及双极细胞、节细胞均有凋亡，且凋亡发生以内外核层为主，节细胞层亦有少数细胞发生凋亡，这在国内尚未见报道，而脾气虚证加重了RD复位后视网膜各层细胞的凋亡。

益视汤是在前人用药基础上结合RD复位后病理改变及现代中药药理研究结果自行组方的中药汤剂，全方由9味药物组成，以具有补气固脱作用的人参、黄芪作为君药，以车前子等利水药作为臣药，以补肝肾、养阴血的枸杞等作为佐药，以茺蔚子作为使药直达目系，全方共奏补气利水养阴的作用。研究结果表明，益视汤能够提高实验兔血清抗氧化能力，减轻脾气虚证加剧的机体脂质过氧化损伤，进而降低视神经细胞丢失。现代药理研究结果也表明，组方中含有的人参皂甙Rg1具有清除自由基、抗氧化作用及阻止神经细胞凋亡、促进神经细胞生长作用，黄芪、枸杞子有促进视网膜神经细胞增殖等作用，具体作用机制还有待进一步的研究证实。

以上结果表明，脾气虚证加重了机体氧化损伤及视网膜脱离复位后内外核层及节细胞层细胞凋亡的发生，采用具有益气养阴利水作用的中药经验方益视汤经胃管灌服进行治疗，能够提高机体的抗氧化能力，降低因细胞丢失而导致的严重视功能丧失。

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Experimental study of Yiqi Yangyin diuretic prescription on the anti apoptosis and antioxidant function of the spleen deficiency type after retinal detachment

ZHANG Yan-chun1，LEI Chun-ling1，YANG Xin-guang1，BI Chun-chao1，Sun Juan-ling1，GUO Yan2，ZHU Sai-lin1，LI Ya-fu1
(1.The 4th Hospital of Xi'an，Xi'an 710004，China;2．Shaanxi traditional Chinese medical university，Xianyang 712000，China)

Objective:To investigate the influence of Chinese medicinal decoction with tonifying qi and yin and diuresis on retinal apoptosis in reattached retina of deficiency of spleen-qi rabbit model．Method:42 pigment rabbits were randomly divided into normal control group(A)，RD automatically reattachment group(B)，and RD automatically reattachment with deficiency of spleen-qi group(C)and Chinese medicinal decoction treatment group(D)．Then the reattachment retinal apoptosis were detected with TUNEL staining and electron microscopy in postoperative 10 d，20 d，and 30 d．SOD activities and MDA levels of blood serum were also checked．Result:The morphological features of apoptosis，such as nuclear chromatin condensation and fragmentation as well as cell shrinkage presented in the ONL and INL of B，C and D groups．The results of TUNEL staining revealed the positive cells presented in not only ONL but also INL and NFL in the reattached retina，and apoptotic indexes of C groups increased obviously in 10 d post operation．Compared with A and B groups，the activities of serum SOD decreased and the content of MDA increased．The Chinese medicinal decoction could obviously inhibit the occurrence of retinal apoptosis at any time points，enhanced serum SOD activities and reduced the levels of serum MDA．Conclusion:Our results suggest that the pathology spleen-qi syndrome increase oxidative stress damage and aggravate the retinal apoptosis in retina reattachment．The Chinese medicinal decoction with tonifying qi and yin and diuresis is a potent neuroprotective agent that can salvage retinal neurons in rabbits with retinal reattachment and elevate the ability of antioxidation．

Deficiency of spleen-qi;Retinal detachment;Tonifying qi and yin and diuresis;Apoptosis;Oxidative stress

R774

B

1006-3250(2015)02-0153-06

2014-11-11

西安市科技计划资助项目(GG05138)

张妍春(1974-)，女，陕西人，副主任医师，医学博士，从事玻璃体视网膜疾病及中西医结合眼科的临床与研究。