息风通脑胶囊对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能、脑梗死面积及组织病理学的影响*

胡 莹，曾聪彦，梅全喜，高玉桥，钟希文，戴卫波，林 慧，张文霞

(广州中医药大学附属中山中医院，广州中山 528400)

息风通脑胶囊对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能、脑梗死面积及组织病理学的影响
*

胡 莹，曾聪彦△，梅全喜，高玉桥，钟希文，戴卫波，林 慧，张文霞

(广州中医药大学附属中山中医院，广州中山 528400)

目的:观察息风通脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法:采用改良线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，研究息风通脑胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能、脑梗死面积及组织病理学影响。结果:与模型对照组比较，息风通脑胶囊高剂量组的神经功能缺损评分能显著降低，低、中、高剂量组的脑梗死面积显著降低，息风通脑胶囊各剂量组对造模大鼠大脑病理改变均有一定的影响，其中息风通脑胶囊高剂量组效果最好，可见海马区退变神经元及神经细胞等病理损伤明显减少。结论:息风通脑胶囊能减轻脑缺血再灌注后的大鼠脑损伤。

息风通脑胶囊;脑缺血再灌注;神经功能;脑梗死面积;组织病理学

息风通脑胶囊是广州中医药大学附属中山中医院根据中医理论及多年临床实践研制的治疗急性期缺血性脑中风的行之有效方药，由石决明、珍珠母、钩藤、豨莶草、牡丹皮、赤芍、地黄、田七等中药组成。经我院多年的临床证实，该制剂具有息风通脑、祛痰解毒、活血化瘀之功效，对脑梗死急性期所致的肢体偏瘫、口角歪斜、语言謇涩等具有疗效确切且无副作用，能显著改善患者的健康状态和生活质量，减少后遗症的发生。本文通过建立大鼠急性脑缺血再灌注模型，观察息风通脑胶囊对大鼠神经功能缺损程度、脑梗死面积和大脑组织病理学的影响，以探讨其治疗脑梗塞的作用机制，为息风通脑胶囊的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠，体质量280～350g，由广州中医药大学提供(大学城实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2013-0020)。

1.2 试剂与仪器

息风通脑胶囊(医院制剂，广州中医药大学附属中山中医院制剂室，批号20130911);步长脑心通胶囊(咸阳步长制药有限公司，批号130149);钓鱼尼龙线(直径0.26mm，日本生产);2，3，5-三苯基四氮唑(TTC;美国Sigma公司生产);BX-50型显微镜(日本Olympus)。

1.3 给药途径及药量

健康雄性SD大鼠120只，按随机数字表法分为风通脑胶囊低剂量组XD(0.864g/kg)、息风通脑胶囊中剂量组XZ(1.728g/kg)、息风通脑胶囊高剂量组 XG(3.456g/kg)、步长脑心通对照组 BY (0.864g/kg)、模型对照组MO和假手术对照组JS6组。正常饲养7d后，给药组连续灌胃给药7d，每日1次;MO、JS组给予等量蒸馏水灌胃。

1.4 动物模型制备

末次灌胃1h后对大鼠手术造模，术前12h禁食不禁水，并参照Zea-Longa［2］的大脑中动脉线栓法加以改良。用鱼线制备线栓，头端烧圆口，并在线栓的1.8～2.5cm处做好标记。以10%的水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉大鼠后仰卧位固定，颈部备皮，消毒皮肤，在颈部正中切口分离皮下筋膜及肌肉组织，充分暴露右侧颈总动脉(CCA)及颈内动脉(ECA)、颈外动脉(ICA)，结扎颈总动脉和颈外动脉，于颈总动脉分叉切口处向颈内动脉插入线栓至之前标记处，感觉有阻力即达到大脑中动脉起始部，完全阻断其血流并结扎颈内动脉。术后缝合伤口，用纱布浸泡生理盐水覆盖伤口，并于2h后拔出鱼线。手术期间及术后24h应保持大鼠肛温维持在37℃。假手术对照组仅分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，而后缝合伤口［3-4］。

1.5 标本取材

1.5.1 TTC染色组大鼠脑标本取材 脑缺血2h再灌注24h用10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉大鼠后，沿胸骨旁线剪开胸腹腔暴露心脏、肝脏及主动脉起始端，取灌注针自心尖向右上45°进针至主动脉起始端，固定针头，剪开右心耳，快速灌注生理盐水(200～250ml)至肝脏变白，拔出穿刺针。快速断头取脑，置于－20℃冰箱冷冻15min以备切片。

1.5.2 HE染色组大鼠大脑标本取材 脑缺血2h再灌注24h用10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉大鼠。打开胸腔从左心室插入注射针头，于右心耳部处剪一小口，向内先快速滴入生理盐水10min，然后缓慢滴入至右心耳流出液变清亮肝脏颜色变白为止。然后注入4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液约250ml，灌流固定约30min至肝脏变硬。用大剪刀沿大鼠颈部断头取脑，除去小脑和脑干，取视交叉前后20～30mm冠状切片，放入10%甲醛中固定，24 h内石蜡包埋。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 神经功能缺损评分 参照Longa［2］和Bederon［5］的局灶性脑缺血模型神经功能缺陷5分制评分标准进行评分。0分:无神经功能缺损症状，活动正常者;1分:不能完全伸展左侧前肢者;2分:左侧肢体瘫痪，行走使向左侧旋转，出现追尾现象者;3分:行走时向左侧倾倒，或不能站立者;4分:无自发活动者最为严重。

1.6.2 TTC染色检测脑梗死面积 大鼠以10%水合氯醛麻醉后断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，将所取大脑置于－20℃冰箱中速冻20min，自额极后2mm作等距离A、B、C、D、E冠状连续切5片，然后将脑片放入2%TTC磷酸盐缓冲液中，37℃避光染色30min，正常脑组织呈红色，梗死脑组织为白色。运用Image-ProExpress图像分析系统扫描计算梗死区面积和非梗死区面积。根据公式v= (A1+…An)t/2计算出梗死面积。其中v为梗死体积，A为梗死面积，t为切片厚度。

1.6.3 脑组织病理标本制作 将实验大鼠于缺血再灌注后开胸暴露心脏，从左心室灌注肝素化生理盐水250ml，剪开右心房将血液冲洗干净，然后应用4%多聚甲醛250ml心脏灌注固定。断头取脑常规脱水、透明、浸腊、包埋，常规HE染色、封片，光镜下观察病变区病理变化。

1.7 统计学方法

运用SPSSStatistics19．0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法进行，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 息风通脑胶囊对大鼠神经功能缺损评分的影响

表1显示，假手术对照组大鼠没有神经功能缺损表现，评分均为0分。模型对照组、阳性对照组、息风通脑胶囊低、中、高剂量组均出现不同程度的神经功能缺损症状，在缺血再灌注24h后，各组神经功能缺损评分均小于模型对照组，其中BY、XG组与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05); XD、XZ剂量组虽然也有一定改变，但效果不明显，差异无统计学意义。

表1 息风通脑胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤神经功能障碍的影响(±s)

表1 息风通脑胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤神经功能障碍的影响(±s)

注:与假手术对照组比较:△P＜0.05，与模型对照组比较:*P＜0.05

组别 鼠数剂量(g/kg) 评 分模 型 对 照 组MO 10 —2.66±0.78假手术对照组JS 10 — —步长脑心通对照组BY 10 0.864 1.83±0.72*息风通脑胶囊低剂量组XD 10 0.864 2.00±0.74息风通脑胶囊中剂量组XZ 10 1.728 1.92±0.79息风通脑胶囊高剂量组XG 10 3.456 1.83±0.72*

2.2 息风通脑胶囊对大鼠脑梗死面积的影响

表2图1显示，除假手术对照组无梗死灶外，其余各组均出现不同程度的梗死灶。与模型对照组比较，息风通脑胶囊低、中、高剂量组大鼠脑梗死灶面积显著降低(P＜0.05)。

2.3 组织病理学观察

XD组镜下见神经元数目减少，高度水肿，近脑膜处胶质轻度水肿，皮质见少许深染固缩的神经元及少许增生的小胶质细胞，海马周围血管充血，下丘脑可见小灶出血;海马各区细胞排列较规则，可见散在少许深染固缩的神经元，皮质与海马交界处胶质轻度-中度水肿;XZ组镜下见神经元数目众多且排列整齐，近脑膜处胶质轻度水肿，皮质见少许深染固缩的神经元及少许增生的小胶质细胞，下丘脑可见小灶出血，周围脑组织高度水肿，神经元退变，胶质细胞增生;海马各区细胞排列较规则，可见散在少许深染固缩的神经元;皮质与海马交界处胶质轻度水肿;XG组镜下见神经元数目众多，排列较整齐，胶质轻微水肿，皮质见少许深染固缩的神经元，海马各区细胞排列较规则，轻微水肿，偶见深染固缩的神经元;BY组镜下见神经元数目众多，排列整齐，近脑膜处胶质轻度水肿，皮质见少许深染固缩的神经元;海马CA2区、CA3区及PoGD细胞排列较规则，见少许深染固缩的神经元，皮质与海马交界处胶质轻度水肿;MO组一侧皮质镜下见神经元数目减少，排列稀疏，胶质高度水肿，皮质见较多深染固缩的神经元;脑室扩张，一侧下丘脑可见灶性出血，周围胶质高度水肿;海马各区细胞排列较规则，见较多深染固缩的神经元，胶质高度水肿;JS组镜下见神经元数目众多，排列整齐，近脑膜处胶质轻微水肿，皮质见较多深染固缩的神经元;海马各区细胞排列较规则，见少量深染固缩的神经元及小胶质细胞。大鼠大脑组织病理学结果表明，JS组损伤最小，趋近于正常大鼠大脑，MO组大脑损伤最为严重，与MO组比较各给药组大脑损伤程度都有明显改善，其中XG、BY组对大鼠脑梗塞改善情况较XD、XZ组明显(见图2)。

表2 息风通脑胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤脑梗死面积比较(±s)

表2 息风通脑胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤脑梗死面积比较(±s)

注:与假手术对照组比较:△P＜0.05，与模型对照组比较:*P＜0.05

组别 鼠数 剂量(g/kg)脑梗死面积模 型 对 照 组MO 10 —69.63±4.11假手术对照组JS10 — —步长脑心通对照组BY 10 0.864 17.29±4.30*息风通脑胶囊低剂量组XD 10 0.864 20.71±4.99*息风通脑胶囊中剂量组XZ 10 1.728 17.96±2.98*息风通脑胶囊高剂量组XG 10 3.456 15.46±4.22*

图1TTC染色大鼠脑切片

3 讨论

脑梗死属于中医缺血性脑中风范畴，是中风中最常见的一种。中医学对中风的认识已有几千年的历史，积累了宝贵经验。传统中医学认为，中风急性期所产生的病理产物主要为风、火、痰、瘀等毒性物质，而在中风始发态尤以风、火、痰为主，这些毒邪可破坏形体、损伤脑络，参与细胞损伤链的过程。其中常用的中医治法有活血化瘀法、益气活血法、醒脑开窍法、化痰祛瘀通腑法、补肾活血通络法、平肝息风化痰法、养阴活血法等［1］。我们在研究中医药防治脑中风经验的基础上，结合西医学、中药药理学研究成果，选用石决明、珍珠母、钩藤、豨莶草、牡丹皮、赤芍、三七等制成息风通脑胶囊。方中以石决明、珍珠母平肝潜阳，重镇降逆;钩藤、夏枯草、牡丹皮、赤芍、生地以镇肝息风，凉血化瘀;豨莶草、胆南星以清化痰湿，通经活络;大黄通腑泄热，解毒祛邪;蒲黄、三七活血化瘀通络，以上诸药共奏息风通脑、祛痰解毒、活血化瘀之功，故凡急性期缺血性脑中风皆可运用。

图2 息风通脑胶囊对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织病理学改变光镜照片(HE，×400)

现代医学研究认为，神经功能行为异常、脑梗死面积增大、脑组织形态结构改变是脑缺血再灌注导致脑损伤的主要表现，是研究急性缺血性脑中风发病机制的首要问题［6］。本文采用经典的 Zea-Longa［2］法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，即通过颅外置入线栓造成大脑中动脉缺血，为目前国内外较公认的局灶性脑缺血再灌注损伤的造模方法之一。该方法的主要优点是操作成功率高、可重复性好、并发症少、一致性脑梗死效果确实，并能很好地反映脑梗死的临床特点和病理过程，对脑梗死药物防治的疗效评定具有重要意义。实验结果显示，大鼠在脑缺血2h再灌注24h后，均可出现较大面积的脑梗死和脑组织病理损伤以及神经功能缺损评分增高，与模型对照组比较，仅息风通脑胶囊高剂量组可显著降低脑缺血再灌注模型大鼠神经功能缺损评分(P＜0.05)，息风通脑胶囊低、中、高剂量组均可显著降低脑缺血再灌注模型大鼠脑梗死面积(P＜0.05)。此外，组织病理学实验结果也显示，息风通脑胶囊各剂量组均有在一定程度改善局灶性脑缺血脑组织的病理学特征，其中息风通脑胶囊高剂量组效果最好，可见海马区退变神经元及神经细胞等病理损伤明显减少，呈现一定量效关系。综上所述，息风通脑胶囊可通过改善模型大鼠神经功能缺损评分和组织病理学损害、缩小脑梗死面积等方面来改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。

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EffectsofXifengTongnaoCapsuleonNerveFunction，InfarctSizeandPathology onFocalCerebralIschemiaReperfusioninRats

HU-Ying，ZENGCong-yan△，MEIQuan-xi，GAOYu-qiao，ZHONGXi-wen，DAIWei-bo，LIN-Hui，ZHANGWen-xia
(AffiliatedZhongshanHospitalofGuangzhouUniversityofTCM，Zhongshan528400，China)

Objective:ToobservetheprotectiveeffectofXifengTongnaoCapsulesonfocalcerebralischemia reperfusionrat．Methods:Theacutetransientfocalcerebralischemia-reperfusionmodelwasestablishedbymodifiedthreadocclusionmethod．TheeffectsofXifengTongnaoCapsulesontheratsneurologicalfunctionandcerebralinfarctareaand histopathology．Results:Comparedwiththoseofmodelgroup，XifengTongnaoCapsules(3.456g/kg)couldsignificantly reducetheratsneurologicalscore，XifengTongnaoCapsules(0.864，1.728，3.456g/kg)couldreducethecerebralinfarct area，XifengTongnaoCapsules(0.864，1.728，3.456g/kg)haveacertaineffectonthebrainpathologicalchangesinrats．especiallyfor3.456g/kg，couldsignificantlyreducedtheneuronsandnervecellsdegenerationandtheotherpathological changesinthehippocampus．Conclusion:XifengTongnaoCapsulescanreducebraininjuryinfocalcerebralischemiareperfusionrats．

XifengTongnaoCapsules;Cerebralischemiareperfusion;NeurologicalFuntion;Cerebralinfarctarea; Histopathology

R285．5

:B

:1006-3250(2015)08-0936-03

2015-03-12

广东省中山市科技计划资助项目(20122A010)-息风通脑胶囊治疗脑梗塞的实验与临床研究

胡 莹，女，中药师，从事广东地产药材的研究与开发。

△通讯作者:曾聪彦(1975-)，男，教授，主任药师，医学学士，硕士研究生导师，从事中药新制剂开发研究，Tel:0760-89980213，E-mail:zszcy@126．com。