牙周炎对慢性细菌性前列腺炎大鼠前列腺的影响

刘城城，韩广玮，陈江川，易善红，冯小倩 (.第三军医大学新桥医院泌尿外科，重庆400037;.第三军医大学新桥医院口腔科，重庆400037)

慢性细菌性前列腺炎(chronic bacterial prostatitis，CBP)是前列腺被病原体持续或反复感染的一种下尿路感染［1］。近年来发病率持续上升，是泌尿外科临床工作中常见的感染性疾病［2］。牙周炎(periodontitis，PE)是由多种微生物引起的感染性疾病，其导致牙周支持组织破坏、结缔组织附着丧失、牙周袋形成，以及牙槽骨吸收，最终以牙齿松动和缺失为结局［3］，其发病率高达60%～70%［4］。研究发现，中重度前列腺炎合并牙周附着丧失(clinical attachment loss，CAL)大于等于2.7 mm的受试者前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)水平高于中重度前列腺炎合并CAL 小于2.7 mm的受试者以及无/轻度前列腺炎合并CAL 小于2.7 mm 或CAL 大于等于2.7 mm 的受试者［5］。这表明牙周炎与CBP 之间可能存在一种联系，如同腮腺炎引起睾丸炎或者牙周炎与糖尿病之间的双向性关系［6-8］。本实验旨在通过复制CBP 及牙周炎大鼠模型，观察牙周炎对CBP 大鼠前列腺组织病理形态学改变及炎症细胞因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

采用标准致病大肠埃希菌(ATCC25922)，37 ℃培养过夜，以比浊法用无菌生理盐水配成1.5 ×108/mL 浓度菌液，恒温震荡摇床(第三军医大学新桥医院中心实验室提供)，3%戊巴比妥钠(第三军医大学新桥医院中心实验室提供)，10%甲醛溶液(第三军医大学新桥医院中心实验室提供)，光学显微镜(第三军医大学新桥医院中心实验室提供)，直径0.2 mm 的口腔正畸结扎钢丝(第三军医大学新桥医院口腔科提供)，全自动酶标仪(第三军医大学新桥医院中心实验室提供)。

1.2 实验动物与分组

成年远交群(sprague dawley，SD)大鼠80 只，雄性，清洁级，体质量220 ～250 g，由第三军医大学动物实验中心提供。采用抽签法分为4 周组及8 周组，每组各40 只，4 周组及8 周组再采用抽签法每组均分为空白对照组(N 组)、慢性细菌性前列腺炎组(CBP 组)、牙周炎组(PE 组)、慢性细菌性前列腺炎+牙周炎组(CBP+PE 组)，每组各10 只。

1.3 动物模型的建立方法

慢性细菌性前列腺炎模型［9］的建立:3% 戊巴比妥钠(20 mg/kg)用1 mL 无菌注射器腹腔注射，与大鼠腹部皮肤呈斜角30°进针，回抽无液体后将3%戊巴比妥钠注入大鼠腹腔，妥善麻醉后，固定头部及四肢，备大鼠下腹部皮肤，常规消毒铺巾，取大鼠下腹部1.5 ～2 cm 切口，严格无菌操作，无齿镊提起膀胱，暴露前列腺两叶，用1 mL 无菌注射器将浓度为1.5 ×108/mL 菌液注射入前列腺背侧各0.1 mL，N 组注入等量无菌生理盐水。逐层关闭切口，缝皮前用碘伏消毒皮肤。完毕后送回动物房，常规饲料喂养。

牙周炎模型［10］的建立:按慢性细菌性前列腺炎模型方法麻醉大鼠，妥善麻醉后，固定头部及四肢，无齿镊撑开口腔，用口腔正畸结扎钢丝(直径0.2 mm)结扎右上颌第一磨牙牙颈部。完毕后送回动物房，每天高糖饮食喂养(饮用水为10%葡萄糖水，饲料为10%葡萄糖水浸泡变软的常规饲料)。

将大鼠喂养4 周后，腹腔注射过量3%戊巴比妥钠处死4周组所有大鼠，于大鼠麻醉但未死时测量大鼠口腔各项指标，打开腹腔，取出大鼠前列腺组织，大鼠死后取头颅去肉存骨10%甲醛溶液保存右上颌骨。每份前列腺组织分为2 份，1 份放入10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片，HE 染色;另外1 份放入冻存管于-80 ℃冰箱保存。于大鼠喂养8 周后按上述方法处理所有8 周组大鼠。

1.4 观察指标

1.4.1 石蜡切片 10%福尔马林溶液固定24 h，常规石蜡包埋切片，并用HE 染色，每个标本切8 张切片，切片厚度为5 μm，光镜下观察大鼠的前列腺组织中的腺体、导管和间质的变化。根据Bahk 等［11］方法计算石蜡切片中的病理得分:每张切片中随机取5 个高倍视野，计算镜下视野中病变部位与整个视野的面积之比，无病变计0 分，25%的计1 分，50%计2 分，75%计3 分，100%计4 分。

1.4.2 牙周各项指标 探出血指数，检查使用钝头探针。0 表示牙龈健康;1 表示牙龈轻度炎症，表现为颜色有轻度改变并轻度水肿，探诊不出血;2 表示牙龈中等炎症，表现为色红，水肿光亮，探诊出血;3 表示严重炎症:牙龈明显红肿或有溃疡，并有自动出血倾向。牙周袋深度:用细刻度探针探选用牙牙周袋，每牙选近中颊、颊侧、远中颊3 个点测量，取均值。附着丧失:测量牙周袋深度后，当探针尖沿牙根面退出时，探寻釉牙骨质界位置，测得釉牙骨质界到龈缘的距离，将袋深度减去该距离即为附着丧失的程度。牙槽骨吸收值:测量从釉牙骨质界到牙槽嵴顶的长度，每牙选近中颊、颊侧、远中颊3 个点，取均值。

1.4.3 TNF-α 和IL-1β 的检测 取出冻存前列腺组织，剪下一块前列腺组织，其余放-80 ℃冰箱保存，剪碎取下的组织按每100 mg 前列腺组织加入无菌生理盐水1 mL 的比例，将无菌生理盐水和剪碎的前列腺组织加入小烧瓶，将小烧瓶放入冰水浴中，然后用匀浆器搅拌充分制成匀浆(注意搅拌时要间断暂停，以防止匀浆过热变性)。将搅拌好的匀浆吸取加入离心试管中，3 000 r/min 离心10 min，取匀浆上清液。采用双抗体夹心ELISA 法定量分析各组大鼠前列腺中TNF-α 和IL-1β 的表达，ELISA 试剂盒购于BOSTER 公司，具体操作严格按照试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 各组前列腺病理情况

4 周和8 周的N 组、PE 组大鼠前列腺皱襞较多，腔隙大小不一，间质内少量结缔组织及纤维结缔组织，无淋巴细胞等炎性细胞浸润，无纤维组织增生(图1a、b、e、f)。4 周和8 周的CBP、CBP+PE 组可见前列腺腺上皮增生、腺体肿胀扩张，淋巴细胞、单核细胞等炎性细胞浸润腺腔及间质，纤维组织增生，大体呈现慢性细菌性前列腺炎改变(图1c、d、g、h)。8 周CBP、CBP+PE 组前列腺虽然呈现慢性炎症改变，但是与4 周CBP、CBP+PE 组比较可见腺上皮及纤维组织增生有所改善，淋巴细胞、单核细胞等炎性细胞浸润减少。

2.2 前列腺炎症评分

各组前列腺炎症评分如表1 所示，无论是在4 周组还是8周组中，CBP + PE 组和CBP 组炎症评分均较N 组、PE 组高(P ＜0.05)，其中4 周和8 周的PE 组和N 组之间以及4 周CBP+PE组和4 周CBP 组之间无明显差异(P ＞0.05)，8 周CBP+PE 组高于8 周CBP 组(P ＜0.05)，4 周CBP+PE、CBP 组较8 周CBP+PE、CBP 组高(P ＜0.05)。

2.3 前列腺中TNF-α 和IL-1β 水平

各组TNF-α 和IL-1β 如表2 所示，CBP+PE 组、CBP 组较N组和PE 组高(P ＜0.05)，其中PE 组和N 组之间以及4 周CBP+PE、CBP 组之间无明显差异(P ＞0.05)，8 周CBP+PE 组高于8 周CBP 组(P ＜0.05)，4 周CBP + PE、CBP 组较8 周CBP+PE、CBP 组高(P ＜0.05)。

2.4 牙周各项指标

各组大鼠牙周各项指标如表3 所示，PE 组及CBP +PE 组较N 组及CBP 组高(P ＜0.05)，其中PE 组与CBP +PE 组之间、N 组与CBP 组之间无明显差异(P ＞0.05)，8 周N 组及CBP组与4 周N 组及CBP 组之间无明显差异(P ＞0.05)，但是8 周PE 组及CBP+PE 组牙周各项指标高于4 周PE 组及CBP+PE组(P ＜0.05)。

图1 各组大鼠前列腺病理切片光镜观察(HE ×100)

表1 各组大鼠前列腺炎症评分(±s，n=80)

表1 各组大鼠前列腺炎症评分(±s，n=80)

* :与N、PE 组比较，P ＜0.05;#:4 周与8 周比较，P ＜0.05;△:CBP+PE 组与CBP 组比较，P ＜0.05

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表2 各组大鼠前列腺TNF-α、IL-1β 水平(±s，n=80，pg/mL)

表2 各组大鼠前列腺TNF-α、IL-1β 水平(±s，n=80，pg/mL)

* :与N、PE 组比较，P ＜0.05;#:与8 周比较，P ＜0.05;△:与CBP 组比较，P ＜0.05

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表3 各组大鼠牙周各项指标(±s，n=80)

表3 各组大鼠牙周各项指标(±s，n=80)

* :与N、CBP 组比较，P ＜0.05;#:与4 周相应组比较，P ＜0.05

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3 讨论

慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)是男性中青年的常见病，是我国发病率较高的男性生殖系统感染性疾病之一，占泌尿外科男性门诊患者的25% ～30%［12］。美国国立卫生研究院(NIH)将前列腺炎分为4 型，Ⅱ型为慢性细菌性前列腺(chronic bacterial prostatitis，CBP)［13］。由于前列腺特殊的生理及解剖特点，导致其临床表现多样化，主要表现为会阴部、盆骨区域、腰骶部等部位的疼痛，排尿功能障碍伴感觉异常症状，如尿频、尿急、尿痛、排尿烧灼感、排尿困难，性功能障碍如阳痿、早泄、勃起功能障碍等［14］。慢性前列腺炎患者精浆细菌培养有80%的感染病例可以培养出大肠埃希菌，其余为变形杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等［15］，并且在最近的研究中发现纳米细菌亦能引起慢性前列腺炎［16］。

牙周炎的发病机制复杂，它涉及到一系列的免疫反应与炎症过程。目前对牙周炎发病机制的认识主要是:菌斑及其产物细菌内毒素和细菌酶可直接损伤牙周上皮和结缔组织，引发牙周组织初期炎症，导致牙龈的肿胀和炎症，菌斑激活的宿主细胞释放多种炎症介质，同时激活了宿主防御细胞释放多种炎症介质细胞因子，如肿瘤坏死因子α、白介素1β 等，这些产物导致了牙周组织的继发损伤，其引起的炎症反应扩大到深部组织引发牙周袋形成、附着丧失和牙槽骨吸收，导致牙周组织的降解和破坏［17］。

慢性细菌性前列腺炎与牙周炎在发病机制方面细菌及其产物是必须的始动因子，而炎症细胞因子、免疫反应、精神心理因素、锌含量下降、氧化应激反应等能进一步加重CBP。有文献报道［18-20］，细菌及其产物引发牙周炎后，牙周炎亦能通过炎症细胞因子、免疫反应、精神心理因素、锌含量下降等方面加重。本研究选取N 组、PE 组、CBP 组及CBP +PE 组4 组动物模型，通过比较4 周及8 周两个时间段的各个模型组之间前列腺组织病理形态学改变、炎症评分、TNF-α、IL-1β 的含量及牙周各项指标结果发现，PE 组、N 组之间在前列腺炎症评分、TNF-α、IL-1β 这3 项预示前列腺炎症的指标无明显差异，且低于CBP 组，由此我们认为单纯的牙周炎并不能如腮腺炎引起睾丸炎一样直接诱发慢性细菌性前列腺炎。通过4 周CBP 组和8 周CBP组之间前列腺炎症评分、TNF-α、IL-1β 的比较我们发现大鼠前列腺在4 周时呈现典型的慢性炎症改变而8周时前列腺的慢性炎症改变较4 周明显减轻，这表明大鼠慢性细菌性前列腺炎模型在长时间段的喂养中前列腺的炎症呈自愈改变，然后在8 周CBP 组和8 周CBP+PE 组之间前列腺炎症评分、TNF-α、IL-1β 的比较中，8 周CBP +PE 组明显高于8 周CBP 组，这预示着8 周CBP + PE 组大鼠前列腺炎症程度高于8 周CBP 组大鼠，即牙周炎与慢性细菌性前列腺炎之间的关系如牙周炎与糖尿病之间的关系一样是一种双向性联系，牙周炎能使慢性细菌性前列腺炎大鼠前列腺的自愈能力下降并维持其炎症状态。

通过对上述各时间段各模型组各项观察指标的比较我们总结出以下几点:①单纯牙周炎无法如腮腺炎引起睾丸炎一样在大鼠模型上引起慢性细菌性前列腺炎;②慢性细菌性前列腺炎大鼠模型在长时间段的观察中呈现自愈倾向;③慢性细菌性前列腺炎长时间合并牙周炎，在大鼠模型上能抑制大鼠慢性细菌性前列腺炎的自愈倾向使其保持在慢性炎症阶段。故我们推测牙周炎与慢性细菌性前列腺炎之间呈现了一种双向性关系，而这种关系在细胞水平是如何作用的，并且对牙周炎的治疗能否改善慢性细菌性前列腺炎仍需要进一步研究。

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