蛋白质胶内酶切技术研究进展

姜超张学文潘映红

（1. 湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；2. 中国农业科学院作物科学研究所 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程，北京，100081）

蛋白质胶内酶切技术研究进展

姜超1，2张学文1潘映红2

（1. 湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；2. 中国农业科学院作物科学研究所 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程，北京，100081）

胶内酶切是蛋白质组研究中衔接电泳分离和质谱鉴定的重要环节，对最终的蛋白质定性和定量分析结果有显著的影响。该技术自1992年初步建立以来，一直处于不断完善中，出现了种类繁多的改进方案。为了更有效地利用胶内酶切技术，从凝胶脱色、杂质去除、蛋白酶切、肽段提取4个方面归纳整理了近年来蛋白质胶内酶切技术的主要研究进展。

蛋白质胶内酶切；样品制备；质谱分析；电泳分离；技术进展

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.009

蛋白质胶内酶切是衔接电泳分离和质谱鉴定之间的重要环节。在基于凝胶分离的蛋白质组学研究中，蛋白质混合物样品用一维（1-DE）或二维（2-DE）凝胶电泳分离，得到的蛋白条带或蛋白点被挖出进行胶内酶切，然后利用生物质谱完成蛋白质的分析鉴定，其中胶内酶切是实现可靠的蛋白质定性和定量分析的一个关键步骤［1］。胶内酶切即是将胶内的蛋白质通过蛋白质酶（通常是胰蛋白酶）酶切成肽段，再用溶剂将酶切后的肽段从胶内提取出来供质谱分析，它主要包括凝胶脱色、杂质去除、蛋白酶切及肽段提取4个部分，每一部分的实验细节均对质谱图谱的质量和蛋白鉴定率有明显影响。胶内酶切技术最早建立于1992年［2］，此后一直处于不断完善中，出现了种类繁多的改进方案。该技术的发展已引起越来越多的关注，很多专门研究胶内酶切技术的文献［3-7］陆续发表在各类期刊中，有必要进行系统的总结和分析。

1 染色和脱色

凝胶电泳技术是一种强有力的蛋白质及多肽分离分析工具，而蛋白质染色是其中的重要组成部分。染色方法的改进主要集中在如何提高染色灵敏度，操作是否简捷，成本是否低廉及操作是否安全等方面。传统的考马斯亮蓝染色法灵敏度较低、染色时间较长、凝胶背景偏深，Gauci等［8］开发的胶体考马斯亮蓝染色法，有效提高了染色灵敏度，降低了凝胶背景。相比较而言，银染法的灵敏度更高，但其缺点也很明显，如耗时长、步骤繁多、线性范围小等。Quinten等［9］的文献中还提到用还原糖代替甲醛的银染方法也取得了较好的灵敏度与质谱兼容性。除了考染法和银染法，也使用一类负染法［10］，包括氯化钾、氯化铜、氯化锌、醋酸盐、氯化镍和锌咪唑负染法，其中锌咪唑负染法较常用。荧染法需要特殊的检测仪器和昂贵的试剂，且一般情况下每种蛋白仅少量被标记，荧染凝胶极少用于后续质谱分析。目前与胶内酶切相关的蛋白质染色方法主要有考马斯亮蓝染色法、银染法和负染法。

负染法不染蛋白，只染背景，不需要进行脱色处理，只需除杂和干燥就可进行酶切。考马斯亮蓝和银离子染色后的蛋白质在酶切之前必须进行脱色处理，常规步骤是切取1 mm2胶粒片段放入1.5 mL的EP管中，加入50 μL的脱色液（20%乙腈，50 mmol/L碳酸氢铵，pH 7.0），置于30℃水浴锅中，共脱色两次，每次30 min，中间振荡3-5次，离心去上清［11］。若为银染胶则需在加脱色液前先用30 mmol/L的铁氰化钾或者过氧化氢来氧化银颗粒，再用100 mmol/L的硫代硫酸钠与银离子形成复合物达到脱银目的［12］。

有关脱色方法的改进主要是针对马斯亮蓝染色法和银染法。水与酸、醇等有机溶剂混合液常用于脱色处理，如Cong等［13］在常规脱色前采用1 mL 30% 乙醇（V/V）和10%乙酸（V/V），可明显提高胶块的脱色效率。恒温条件下的脱色处理会导致一部分蛋白的流失，Utrera 等［14］将脱色过程中的温度保持在50℃左右，降低了蛋白质损失。除此之外，Sriswasdi等［15］用50 mmol/L的碳酸氢铵和50%的甲醇来进行处理。Mora等［16］50 mmol/L 的DTT（25 μL），加入到50 mmol/L碳酸氢铵pH8.0的溶液中，56℃放置1 h。上述改进均可明显提高胶块的脱色效率。另外，某些改进的胶内酶切技术还省略了固定、染色和脱色等步骤，即电泳后直接切胶后进行除杂处理，从而简化操作步骤，提高了胶内酶切的效率［17］。

2 杂质去除

盐离子、去垢剂等样品本身携带或电泳时引入的杂质是影响酶切效率和质谱鉴定结果的重要因素，杂质的存在会抑制蛋白酶活性并严重干扰质谱中样品的离子化，因此去除杂质处理是胶内酶切技术中必不可少的部分。

通常情况下，电泳分离可去除多数蛋白样品中的杂质［18］，脱色处理也具有一定的去杂作用。常用的除杂方法是将胶块用超纯水洗涤和超声波处理，最后使用100%乙睛脱水［11］。近年来，一些研究者在脱色处理后使用其他试剂进一步去除SDS和盐离子等杂质，如胡伟等［19］用体积比1∶4的乙醇-氯仿、Takakura等［20］用0.2-0.8 mmol/L盐酸胍、Choksawangkarn等［21］用6-8 mmol/L尿 素、Gorka等［22］用5%甲酸有效置换出胶块中SDS和盐离子等杂质，获得了较好的除杂效果。此外，Niemela等［23］报道去除杂质步骤中使用微波处理也能获得较好的效果。活性炭通常也可以除去盐离子等杂质，但在胶内酶切过程中更多用于酶切后肽段提取液的处理［24］。去除杂质处理应尽可能达到简化实验程序、降低待分析物损失和不引入新杂质等目的。就上述方法而言微波处理是一个比较快速纯净的处理方法，不过微波处理所需的仪器成本较贵。活性炭除杂效果显著但试验程序较繁琐。其他溶液的杂质去除方案一定程度上都可以去除胶内的杂质离子，然而溶剂的加入可能会引入别的新杂质。

3 蛋白酶切

顾名思义凝胶里面的蛋白质酶切就是胶内酶切，所以蛋白质酶切是胶内酶切处理过程中的一个非常重要的技术环节。经过染色脱色和除杂处理后，为了保证酶切效果，1DE电泳分离的蛋白质在酶切前还常用DTT和碘乙酰胺对胶块进行还原和烷基化处理，而2DE电泳分离的蛋白质在第二维分离前已经过还原和烷基化处理，经脱色和除杂可直接用蛋白酶切成肽段［25］。胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶是酶切处理中常用的蛋白质酶，但经典的胶内酶切方法是用乙腈干燥凝胶后，每1 mm2胶粒加入10 μL胰蛋白酶终浓度约为10 ng/μL的50 mmol/L碳酸氢铵溶液，冰浴1 h使胶粒再水化后，除去过量的胰蛋白酶溶液，加入10 μL 50 mmol/L碳酸氢铵覆盖胶粒，37℃酶切16 h［11］。

如何提高酶切效率是蛋白质胶内酶切技术研究的重点之一，许多科学家都致力发展一些新的技术方法来实现这一目标。近年来不同种类的表面活性剂和去垢剂的使用，显著提高了蛋白质胶内酶切反应的效率。王鸿丽等［12］在酶切过程中加入非离子去污剂正十二烷麦β-D-芽糖苷，利用该去污剂对蛋白质的去折叠和增溶作用，缩短了蛋白质的胶内酶切时间，提高了肽的质量和覆盖率。Leon等［26］使用了小分子表面活性剂 RapiGest SF浓度为0.5%-1%用于改进电泳分离的蛋白质的鉴定效率，成功缩短了酶切时间，提高了肽段的提取率。另外，Saveliev等［27］利用一种可以促进凝胶中蛋白质快速溶解和变性的表面活性剂，增强了亲脂性膜蛋白的酶切效率，同时这种表面活性剂随后可被降解掉，因而具有较好的质谱兼容性。

近年许多科学家也在寻找一些新的技术来缩短蛋白质的酶切时间。有报道表明微波辅助酶切也是一种快速方便的方法。Damm等［28］将微波技术用于标准蛋白的胶内酶切过程，利用微波对酶切过程中温度的控制作用，通过调节微波仪器的参数，设置温度梯度，改善了酶切效率。Ruan等［29］用微波技术在短时间内完成折叠紧密的难变性的蛋白质的酶切。Lin等［30］还测试了各种溶液中的微波辅助酶切效率，结果表明当酶切反应发生在含有乙腈、甲醇和氯仿的溶液中时，微波酶切的效率会有所提高。Lopez-Ferrer等［31］综合使用微波、超声波及高压循环技术，提高了酶切样品的纯度。这些方案都满足了实际研究中对快速或高通量胶内酶切的需求。近年来超声波技术在蛋白质胶内酶切中也得到一些应用。成结等［32］用2 mm超声破碎仪探头伸入含蛋白质酶溶液中，超声功率20 W，工作时间 60 s，两个循环后，再加入微量的胰蛋白酶，再次超声两个循环，可快速完成酶切。Araujo等［33］利用超声波来提供高温度和高压的辅助酶切条件，实现了快速有效的胶内酶切。利用超声波技术可以在短时间内实现蛋白质的酶切，缩短了酶切的时间，增加了蛋白质组学研究的通量，是目前新开发的蛋白质快速酶切方法。使用在线酶反应器或固定化酶反应柱［34，35］也是一种快速进行蛋白质酶切的方法。酶的固定化是指通过吸附、包埋、交联、共价接合等方法使目标酶分子固定于特定的载体上而发挥酶的生物催化作用。与普通的蛋白质酶解反应相比，固定化的酶具有更高的（酶/底物）比例、更高的酶解效率、可重复使用，并能减少酶的自身降解等优点。因此蛋白质的在线酶解使得蛋白的鉴定可以更快速、更自动化地完成［36］。

不同的酶缓冲液，以及酶缓冲液中不同的酶终浓度对酶切过程中也起到了至关重要的作用。Xu 等［37］报道使用10 μL 含20 mmol/L碳酸氢铵和0.5 mol/L氯化钙酶缓冲液，胰蛋白酶终浓度为10 ng/μL，可获得较好酶切效率。Antrobus 等［38］认为加入20 μL 含10 mmol/L碳酸氢铵和10%乙腈的酶缓冲液，胰蛋白酶终浓度为12.5 ng/μL时，酶切效果更好。这些实验提示改变酶浓度和酶缓冲液的配比，能够进一步增强酶的作用效果，提高酶切效率。酶切缓冲液的pH值对酶切效果也有显著的影响。最近Pernemalm［39］、Paasch［40］、Bae［41］等研究者较深入研究了不同pH的缓冲液对酶切效率的影响，希望找出不同酶切反应中最适pH值。

总而言之，蛋白质酶切反应过程中目标蛋白酶解是否完全、酶切位点是否特异、酶切片段数量的多少以及酶自切程度的高低，都会直接影响蛋白定性和定量结果，需要优化和改进胶内酶切技术条件，才能得到高纯度，高稳定性的质谱分析样品。

4 肽段提取

胶内酶切技术中，酶切后肽段提取的重要性常被忽视。进行胶内酶切时各种参数的调整优化，如样品的处理、酶与蛋白质的比例、酶切缓冲液的构成和酶切的条件等，均可提高多肽得率，但如何有效地将酶切后生成的肽段从胶块基质中分离提取出来，是整个蛋白质胶内酶切过程中最后需要考虑的问题。目前通常使用含乙睛和三氟乙酸的溶液分离提取胶粒中的肽段，即酶切结束过后，加入5%的TFA，40℃保温1 h后，将上清液移入新管，再加入含2.5%TFA和50% CAN的新提取液，30℃保温1 h，合并两次获得的肽段提取液，真空干燥后-80℃保存。

肽段提取过程中需反复淋洗管壁，尽可能减少管壁对肽段的吸附［42］。对蛋白质含量非常低的胶点，可能需要合并多块凝胶以提高样品肽段的含量［43］。肽段提取物还可以通过C18柱进一步除杂，以降低对质谱的污染，提高鉴定率［24］。ZipTipC18枪头既可以脱盐除杂又能快速简便地富集多肽片段，是处理微量肽段提取液的有效工具，Mou等［44］运用基于ZipTipC18的肽段提取方法，成功制备了高浓度的肽段。近年还有很多文献报道使用甲酸和乙腈的混合液来提取肽段，如Zhang等［45］用5%的甲酸和50%的乙腈混合溶液来完成肽段提取。由于不同肽段在不同提取液中溶解性有差异，Takakura等［20］设计了10%-50%乙腈浓度梯度的分段提取方式，获得了较好的提取效率。

5 其他问题

进行蛋白质胶内酶切的目的是为进一步的质谱分析提供适宜的样品，因此整个酶切过程中还要严格控制各种干扰质谱分析的污染。最常见的污染是源自人体的角蛋白，其次是橡胶手套表面可能存留的滑石粉［46］。实验室中的各种塑料耗材中的聚乙二醇（PEG）等塑化剂也是严重干扰质谱分析的污染物，应尽量使用优质吸头与离心管。其他化学试剂也应该尽量用高纯度、高品质产品。最后，如果遇到酶切位点少或分布极不规则的蛋白质，常规酶切很难得到好的肽谱，可以考虑换一种蛋白酶进行酶切。

6 展望

利用生物质谱定性和定量分析凝胶电泳分离后的蛋白质在蛋白质组学研究中具有重大意义，其中蛋白质胶内酶切对质谱分析结果有极为显著的影响。蛋白质的质谱分析特别是复杂的蛋白质混合样品的质谱分析，是检测种类繁多的低含量肽段的仪器分析过程，之前进行胶内酶切时产生的任何微小的肽段损失或污染均可能造成严重后果。在质谱分析中若想得到可信度高和重复性好的定性定量结果，就必须优化凝胶脱色、杂质去除、蛋白酶切、肽段提取4个主要的胶内酶切步骤，以减少肽段损失并提高酶切产物纯度。迄今为止，针对胶内酶切技术的4个主要步骤已有较多的调整和改进，根据具体的样品特性及实际情况，借鉴和参考已有的研究，进一步提高质谱鉴定的成功率和质谱定量准确性。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Progress on Technology of In-gel Protein Digestion

Jiang Chao1，2Zhang Xuewen1Pan Yinghong2
（1. College of Bbioscience and Biotechnology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128；2. Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Beijing 100081）

In-gel digestion is the important step that connects electrophoresis separation and mass spectrometry identification in proteome research， and can significantly affect the results of qualitative and quantitative analysis of proteins. The technology was firstly proposed in 1992，and from then on， many progresses have been made and various improvement plans have been developed. In order to more effectively use the technology of in-gel digestion， the progress on the aspects of gel decoloration， impurity removal， protein digestion and peptides extraction were reviewed from the literature.

in-gel protein digestion；sample preparation；mass spectrometry；electrophoretic separation；technical progress

2014-06-18

国家“863”计划项目（2008AA10Z115），国家自然科学基金项目（30971874），转基因生物新品种培育科技重大专项（2009ZX-08012-011B），中国农业科学院科技创新工程（作物分子标记技术及其应用科研创新团队）

姜超，男，硕士研究生，研究方向：细胞生物学；E-mail：1025160733@qq.com

潘映红，男，研究员，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail：panyinghong@caas.cn