响应面法优化鱿鱼(Ommastrephes bartrami)皮胶原蛋白提取液脱色工艺*

张　雪　令狐青青　童晓倩　毛贵珠　罗红宇　宋　茹

(浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室　浙江海洋学院食品与医药学院　舟山　316022)

鱿鱼(Ommastrephes bartrami)属海洋头足类, 无脊椎软体动物, 富含蛋白质、脂肪、矿物质及维生素等多种营养成分, 是我国一种非常重要的水产品加工原料。鱿鱼在加工过程中大约产生 15%—30%的头、足、内脏及表皮等废弃物, 其中鱿鱼皮约占废弃物总量的 8%—10%, 主要由结构蛋白——胶原蛋白组成(郭无瑕等, 2006)。以往胶原蛋白的提取主要从陆地动物的皮、骨、筋腱中获得, 但是近年来由于一些人畜共患病爆发, 如: 疯牛病、禽流感、口蹄疫等,陆地动物源胶原蛋白的安全性引发公众关注。相比之下, 海洋动物源胶原蛋白则具有更高的安全性, 鱿鱼皮中胶原蛋白除了可以直接食用外, 还富含甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸, 对皮肤有良好的修复和滋养作用。此外, 国内外大量研究还报道鱿鱼皮胶原蛋白水解液具有抗氧化、降血压、调血脂、提高免疫力等生理活性(刘克海等, 2008; Giménezet al, 2009; Alemánet al, 2011, 2013; Gómez-Guillénet al, 2011; LINet al,2012; Veerurajet al, 2015)。

胶原蛋白可以采用酸法、碱法和酶法提取, 但是颜色较深的胶原蛋白提取液需要经过适宜的脱色处理才能进一步应用。蛋白质及其水解液的脱色主要采用化学法和物理法, 化学脱色法因为加入氧化型或还原型化学试剂, 所以对脱色液中各组分理化性质影响大, 而且也存在安全隐患。物理脱色法主要通过吸附作用完成, 因此对脱色液性质影响小, 安全性高。活性炭吸附法是一种常用的物理脱色法, 具有吸附效果好、成本低, 且对样品液影响小等优点, 因此广泛被用于食品中蛋白液、糖浆、酱油等脱色处理(Sessaet al, 2008; 孙玉军等, 2012; 周统武等, 2013;谢建华等, 2013; Miyagiet al, 2013)。在前期研究中,用酸法提取的鱿鱼皮胶原蛋白提取液为红棕色, 本文选择粉末活性炭为吸附剂, 研究吸附条件对鱿鱼皮胶原蛋白提取液脱色效果影响, 然后采用响应面分析法优化活性炭吸附脱色条件, 并分析脱色后鱿鱼皮胶原蛋白提取液的蛋白质含量及氨基酸组成变化, 旨在为鱿鱼皮胶原蛋白的应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

鱿鱼皮由浙江省舟山市富丹旅游食品有限公司提供; 粉末活性炭购于上海国药化学试剂集团; 正丁醇(食用级); 其余试剂均为国产分析纯。

1.2　主要仪器设备

CU420型电热恒温水浴锅, 上海棱光技术有限公司; 721G型可见分光光度计, 上海精密科学仪器有限公司; TGL-16C型高速离心机, 上海安亭科学仪器厂; CH-420型电热恒温水槽, 上海一恒科技有限公司;L-8900型氨基酸分析仪, 日本日立公司。

1.3　试验方法

1.3.1鱿鱼皮胶原蛋白提取液的制备冷冻保藏的鱿鱼皮先用流动水解冻, 清洗干净后切碎, 加入10%正丁醇浸没鱼皮, 4°C下萃取24 h除去脂类, 将脱脂的鱼皮用蒸馏水冲洗干净。根据鱼皮质量, 按照1︰6 (W:V)比例加入0.05 mol/L NaOH, 室温浸泡60 min,充分溶胀鱼皮后用蒸馏水洗至中性, 再按照鱼皮质量以1︰5 (W:V)比例加入0.5 mol/L冰醋酸, 匀浆,将匀浆液在 40°C恒温水浴搅拌器中抽提 6 h, 然后4000 r/min离心20 min, 弃去不溶物, 得到颜色发红的鱿鱼皮胶原蛋白提取液, 经旋转蒸发浓缩后置于4°C 冷藏, 备用。

1.3.2鱿鱼皮胶原蛋白提取液中色素特征吸收波长鱿鱼皮胶原蛋白提取液呈红棕色, 说明在可见光区有特征吸收。将鱿鱼皮胶原蛋白浓缩液用0.5 mol/L的冰醋酸适当稀释, 然后在400—800 nm进行可见光谱扫描。

1.3.3活性炭吸附影响因素采用活性炭吸附法对鱿鱼皮胶原蛋白提取液进行脱色, 在前期研究中发现粉末型活性炭对鱿鱼皮胶原蛋白提取液中色素吸附效果好于颗粒型活性炭。所以, 本研究采用粉末型活性炭为吸附剂, 分别研究活性炭添加量(1.0%—8.0%)、脱色时间(10—70 min)、溶液pH值(2.4—7.4)和脱色温度(10—40°C)对鱿鱼皮胶原蛋白提取液脱色效果影响。

1.3.4活性炭吸附鱿鱼皮胶原蛋白提取液色素条件优化在研究活性炭对鱿鱼皮胶原蛋白提取液色素脱除效果的基础上, 选择活性炭用量、胶原蛋白提取液pH值和脱色温度进行三因素三水平的响应面分析Box-Behnken中心组合试验, 试验因素水平及编码值见表1, 特征波长下胶原蛋白提取液色素的吸光值为响应值, 采用Design Expert Software (version 7.1.4,USA)软件对结果进行Quadratic模型拟合:

式中,y表示响应值,Xi和Xj代表因素水平,β0、βj、βjj和βij分别表示常数项、一次项、二次项和交互项系数。

1.3.5蛋白质含量测定考马斯亮蓝法(Bradford,1976), 牛血清白蛋白为标准品。

1.3.6氨基酸组成分析取冻干样品适量, 加入15 mL的6 mol/L HCl溶解, 在110°C下氮气保护水解22 h, 冷却后转移至25 mL容量瓶中定容。取1 mL水解液用55°C氮气吹干, 加入1 mL蒸馏水再烘干,反复 3次, 再用 0.02 mol/L HCl溶解定容至 1 mL,0.45μm滤膜过滤, 取滤液 20μL上 L-8900型氨基酸分析仪测定。

1.4　数据统计分析

鱿鱼皮胶原蛋白提取液色素脱除结果用平均值±标准差表示(n=2),P＜0.05表示差异显著。

2　结果与讨论

2.1　鱿鱼皮胶原蛋白提取液色素特征吸收波长

如图1所示, 鱿鱼皮胶原蛋白提取液在 400—450 nm有一个非常明显的吸收峰, 经测定确定鱿鱼皮胶原蛋白提取液中色素的特征吸收波长为420 nm(图1b)。

图1　鱿鱼皮胶原蛋白提取液可见吸光光谱Fig.1　The absorbance spectrum of collagen extract from squid skin

2.2　鱿鱼皮胶原蛋白提取液脱色条件

活性炭对色素类具有良好的吸附作用, 前期研究中发现粉末活性炭的脱色效果好于颗粒活性炭。所以采用粉末活性炭为吸附剂, 分别研究活性炭添加量、脱色时间、吸附pH值和脱色温度对鱿鱼皮胶原蛋白提取液色素脱除影响, 结果见图2。

图2　各因素对鱿鱼皮胶原蛋白提取液色素脱除影响Fig.2　Effects of each factor on the decoloring of collagen extract from squid skin

粉末活性炭具有多孔结构, 适当地加大活性炭用量能提高对色素的物理性吸附作用, 但是当吸附达到饱和时, 加大活性炭用量并不能有效提高色素的脱除效果(陈荔红等, 2009)。从图2a可以看出, 随着活性炭用量的增加, 鱿鱼皮胶原蛋白液在 420 nm处吸光值逐渐地降低, 在活性炭添加量 4.0%时脱色液的吸光值最低。当活性炭添加量大于5.2%时, 脱色液的吸光值反而略有增加, 说明此时活性炭吸附已经达到饱和, 而且添加过多粉末活性炭也不利于后续离心分离, 而脱色液中残留的活性炭粉末会造成吸光值的增加。

由图2b可知, 延长脱色时间有助于活性炭与色素分子的充分接触, 从而提高吸附效果。当脱色时间为 30 min时, 鱿鱼皮胶原蛋白脱色液的吸光值最低, 而后增加脱色时间并没有进一步地提高脱色效果。

图2c结果显示, 在偏酸性pH值下, 活性炭吸附鱿鱼皮胶原蛋白液中色素效果好, 而在 pH值为 7.4时, 脱色液在 420 nm处吸光值剧烈增加, 说明该条件下活性炭吸附色素能力急剧降低。

从图2d可以看出, 脱色温度在10—35°C时, 活性炭的脱色效果随着脱色温度的升高而逐渐地增强,说明活性炭吸附鱿鱼皮胶原蛋白液中色素应是一个吸热过程, 脱色温度的提高有助于增加活性炭颗粒能量, 结果提高了与色素分子碰撞几率, 从而提高脱色作用。此外, 适当地提高吸附温度也有利于降低鱿鱼皮胶原蛋白液的黏度, 减少与活性炭分子间作用阻力, 有助于提高吸附作用。当脱色温度大于 35°C时, 鱿鱼皮胶原蛋白脱色液在420 nm处吸光值又开始上升, 可能与色素在较高温度下从活性炭上解吸有关(陈荔红等, 2009)。

2.3　鱿鱼皮胶原蛋白提取液脱色工艺优化

因为活性炭对氨基酸、肽、蛋白质等有吸附作用,而动物蛋白色素常与蛋白质结合在一起, 所以为了尽量降低蛋白质损耗率, 吸附作用应控制在短时内完成。由图2b结果可知, 脱色时间为30 min时, 活性炭对鱿鱼皮胶原蛋白液的脱色作用基本完全, 所以选择活性炭添加量、溶液pH值和脱色温度做响应面分析试验进一步优化脱色条件, 具体因素编码值和实际值见表1, 试验安排和结果见表2。

表1　响应面分析Box-Behnken中心组合试验因素编码值和实际值Tab.1　Experimental code and corresponding real values in the Box-Behnken design of response surface method

表2　响应面分析Box-Behnken中心组合试验安排和结果Tab.2　Experimental design and results of Box-Behnken response surface method

根据表2中数据进行Quadratic回归方差模型拟合, 得到活性炭吸附鱿鱼皮胶原蛋白提取液中色素方程为:

对模型拟合结果进行方差分析, 结果见表3。

表3方差分析结果显示模型P值小于0.0001, 表明该模型极显著(P＜0.01), 且相关系数R2= 0.9783,说明各因素值和响应值之间的关系可以用 Quadratic模型进行函数化, 实验确定的回归方程能够代替真实点的预测结果。当P＜0.05时, 因素对结果影响显著, 由此可以看出表3中各因素一次项、交互项和二次项对响应值均有显著性影响。在脱色时间为30 min条件下, 表2数据经 Quadratic回归模型拟合得到活性炭吸附鱿鱼皮胶原蛋白液色素最佳条件为: 活性炭添加量 4.2%, 胶原蛋白液 pH值 2.27, 脱色温度35°C。鱿鱼皮胶原蛋白提取液在该条件下脱色后理论特征吸光值(OD420nm)为 0.854, 经验证脱色后鱿鱼皮胶原蛋白液的实际特征吸光值为 0.839, 与理论值一致, 色素脱除率为45.6%。

活性炭添加量和pH值(x1x2)、活性炭添加量和脱色温度(x1x3)和 pH 值和脱色温度(x2x3)的交互作用与鱿鱼皮胶原蛋白液色素脱除效果关系, 结果见图3。

从图3a能够看出, 鱿鱼皮胶原蛋白提取液中色素脱除效果总体趋势是随着活性炭添加量的增加而逐渐地增强, 即: 420 nm下特征吸光值逐渐地降低。特别是在pH 2.6—2.0时, 吸光值下降趋势更为明显,说明活性炭用量对提取液色素脱除具有线性影响。当pH值3.0时, 活性炭添加量对胶原蛋白液中色素脱除效果影响平缓。而且粉末活性炭添加量过大时, 有一些粉末活性炭会漂浮在提取液表面, 后面的离心处理也很难再除去, 所以未考查活性炭添加量大于4.8%时对胶原蛋白液的脱色效果。

图3b显示, 在相对较低脱色温度25°C时, 活性炭添加量的加大对胶原蛋白液色素的脱除影响不明显, 表现为胶原蛋白液吸光值变化平缓。同样, 当活性炭添加量较低时, 如: 3.6%, 脱色温度对胶原蛋白液中色素脱除影响平缓。而当活性炭添加量为 4.8%时, 鱿鱼皮胶原蛋白液色素的脱除随着脱色温度的升高而增强。由此可以判定活性炭添加量和脱色温度在实验设定的较高水平时对胶原蛋白液色素脱除影响显著, 因脱色温度大于 35°C不利于鱿鱼皮胶原蛋白液色素的脱除(见图2d结果), 所以图3b未考查脱色温度大于35°C情况。

由图3c可知, 鱿鱼皮胶原蛋白液的pH值为2.4—3.0时, 提高脱色温度有利于活性炭吸附色素, 但当 pH值小于 2.4时, 脱色温度对胶原蛋白提取液色素的脱除影响比较平缓。

2.4　蛋白质含量和氨基酸组成分析

测定优化条件下活性炭吸附鱿鱼皮胶原蛋白液色素后蛋白质含量, 分析氨基酸组成变化, 未脱色样品为对照, 具体结果分别见图4和表4。

图4　鱿鱼皮胶原蛋白提取液的蛋白质含量变化Fig.4　Changes in protein content of collagen extract from squid skin

活性炭对色素类物质的吸附具有非特异性, 在吸附色素时, 溶液中蛋白质、肽以及氨基酸类也同时被吸附(Sessaet al, 2008)。徐曼等(2013)用粉末活性炭对豆粕蛋白酶解液进行脱色处理, 结果发现最优脱色条件下(溶液 pH 4.0, 粉末活性炭用量 0.6%, 脱色温度 50°C, 吸附时间 50min), 豆粕蛋白酶解液肽的损失率为24.96%。章绍兵等(2011)报道粉末活性炭对花生蛋白酶解液脱色(溶液 pH 3.2, 活性炭用量 8%,吸附温度55°C, 吸附时间30min)后蛋白损失20.86%。上述文献报道虽然活性炭吸附条件不同, 但是脱色液中蛋白质及肽类损耗在20%左右。图4中鱿鱼皮胶原蛋白液的蛋白质含量由脱色前 890.26μg/mL降至脱色后715.27μg/mL (P＜0.05), 蛋白质损失率为19.65%, 与上述文献报道结果一致。

由表4氨基酸分析结果可知, 鱿鱼皮胶原蛋白提取液的氨基酸总量由脱色前765.72 mg/g降至脱色后590.16 mg/g, 损耗率为22.93%, 略高于图4蛋白质损耗率。甘氨酸含量无论是脱色前(175.67 mg/mL,22.94%)还是脱色后(136.02 mg/g, 23.05%)均最高, 谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和丙氨酸含量也较高, 而酪氨酸和组氨酸含量较低, 符合水产胶原蛋白氨基酸和I型胶原蛋白氨基酸特点(李八方等, 2013; 侯虎等,2013; 夏珊珊等, 2014)。此外, 鱿鱼皮胶原蛋白液中蛋氨酸和半胱氨酸总量不到 1%, 与胶原蛋白几乎不含有含硫氨基酸报道一致(李八方等, 2013)。表4结果显示活性炭脱色后, 鱿鱼皮胶原蛋白提取液的半胱氨酸含量增加了一倍, 应与酸性条件下活性炭吸附促进蛋氨酸转化为半胱氨酸有关。脱色液中一些氨基酸, 如: 异亮氨酸、天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸和赖氨酸的损耗率要高于其它氨基酸, 可能与活性炭吸附的蛋白质或色素蛋白中这几种氨基酸含量相对较高, 或者与活性炭直接吸附这些游离氨基酸有关。

表4　鱿鱼皮胶原蛋白提取液的氨基酸组成分析Tab.4　Amino acid analysis for collagen extract from squid skin

3　结论

活性炭吸附法能有效减少鱿鱼皮胶原蛋白提取液的色素值, 当脱色时间为30 min时, 经响应面分析得到活性炭最佳脱色条件为: 活性炭添加量 4.2%,溶液pH 2.27, 脱色温度35°C。在最优条件下, 鱿鱼皮胶原蛋白提取液的脱色率为45.6%, 蛋白质和氨基酸损耗率在20%左右。氨基酸分析显示脱色后的鱿鱼皮胶原蛋白具有水产胶原蛋白氨基酸和I型胶原蛋白氨基酸特点。但是, 如何利用被活性炭吸附的蛋白质或氨基酸, 还有待进一步深入研究。

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