苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64基因的原核表达

张佑红，熊瑶，周锋，徐智鹏，谌颉，陈杏洲

1.武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430074；2.绿色化工过程教育部重点实验室（武汉工程大学），湖北 武汉 430074

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64基因的原核表达

张佑红1，2，熊瑶1，2，周锋1，2，徐智鹏1，2，谌颉1，2，陈杏洲1，2

1.武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430074；2.绿色化工过程教育部重点实验室（武汉工程大学），湖北 武汉 430074

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒囊膜蛋白Gp64是杆状病毒感染宿主细胞的重要功能蛋白之一.通过Oligo6．0设计一对特异性引物，用于扩增Gp64基因的部分DNA片段，对聚合酶链式反应扩增得到的DNA片段进行纯化，并对纯化后的双酶切DNA片段与经同尾酶双酶切后的原核表达载体pET28a进行连接；对捕获有重组质粒pET28a－Gp64的大肠杆菌BL21（DE3）细胞进行异丙基硫代半乳糖苷诱导，通过SDS－PAGE对诱导产物进行电泳分析，结果表明扩增的目的片段获得了表达；采用电透析的方法纯化了该蛋白，为进一步制备抗Gp64蛋白抗体做准备.

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒；Gp64蛋白；Gp64基因；表达；纯化

0 引言

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）是杆状病毒科核型多角体病毒属的典型代表，该病毒的基因组为134 kb的环状单一双链DNA分子.由于AcMNPV DNA含有大量多克隆序列，这些序列不是病毒DNA复制所必需的，能容许基因缺失或替换，故常用作外源基因的表达载体［1－3］.AcM NPVC在感染宿主后有非包涵体病毒（BV）和包涵体病毒（OV）两种表现型［4－5］.Gp64蛋白是BV的重要组成部分，由512个氨基酸残基构成，其分子量约为64 kD.Gp64蛋白是第三类过滤性的膜融合蛋白，主要以二硫键相连的三聚体形式存在于杆状病毒BV颗粒的一端，GP64基因是杆状病毒结构蛋白基因中唯一既有早期启动子又有晚期启动子的基因，是病毒通过吸附、包吞作用进入宿主细胞的关键功能蛋白基因之一［6－7］，在病毒吸附内吞进入宿主细胞的过程中，依赖环境中的酸性pH，通过与膜融合使病毒粒子进入细胞［8］.本研究通过PCR扩增AcMNPV Gp64基因中长度为963 bp的DNA片段，利用软件计算其编码的蛋白质分子量约40 kD，将该基因克隆到原核表达系统中并成功表达截短的Gp64基因，用透析袋电洗脱法对表达的目的蛋白进行纯化，获得较纯净的Gp64蛋白，利用该蛋白进行大白兔免疫实验制备抗Gp64蛋白抗体［9］.

1 实验部分

1.1 材料

大肠杆菌质粒pET28a由华中农业大学生命科学院提供，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV Bacmid由南阳理工师范学院提供，大肠杆菌BL21（DE3）和克隆型DH10B菌株由本实验室保存.

实验过程所需要的限制性内切酶，T4 DNA连接酶，DNA、蛋白质Marker以及pGEM－T Easy Vector（T载体）均购自宝生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 有AcMVPV Bacmid全基因组提取具体AcMVPV Bacmid DNA抽提方法参见Guide to BEVS and Insert cell culture Techniques.

1.2.2 引物设计及PCR根据在NCBI上面搜索出的1500 bp大小Gp64基因的DNA序列，去掉其跨膜区域周围约500个碱基.利用DNAman分析其酶切位点，通过Oligo6．0设计1对特异性引物，引物两端分别添加EcoR I和Sal I限制酶切位点，由武汉安基生物公司合成：上游引物为5’－CGGAATTCGTAAGCGCTATTGTTTTA－3；下游引物为：5’－CGCGTCGACTTAAATGTTCATTTTCAGCAA－3＇.用实验室保存的菌种提取的AcMNPV Bacmid质粒为模板，通过PCR合成Gp64基因，扩增的目的片段大小为963 bp.DNA变性温度为95℃3 min；PCR共进行31个循环：94℃1min，50℃1min，72℃1 min，最后再在72℃进行延伸反应10 min，4℃保存备用.

1.2.3 Gp64基因表达载体的构建将特异性片段进行Ta克隆，验证得到的正确克隆产物进行SalI和EcoRI双酶切，对酶切产物进行凝胶回收纯化后与经过XholI、EcoRI双酶切和凝胶回收的原核表达载体pET28a进行连接反应，反应体系10 μL.将连接产物转化到DH10B感受态细胞，培养12 h后对平板上的菌落进行鉴定，包括菌PCR检测，酶切验证和测序验证，对目的重组质粒命名为pET28a－Gp64［10］.其中DNA纯化过程参见天根凝胶回收试剂盒，其它实验步骤参见第三版分子克隆手册.

1.2.4 Gp64基因的诱导表达及电透析纯化制备野生型E．coli BL21（DE3）感受态细胞，用于重组质粒pET28a－Gp64的转化.培养12 h后挑取鉴定正确的目的克隆菌接种于10 mL LB培养基中，37℃摇床培养过夜，次日按体积比10%转接到100 mL的LB培养基中培养3 h，并向菌液中加入终浓度为0．3 mmol/L的IPTG［11］，在此作对照试验，其中选择相同的样品不加入诱导剂.30℃，200 r/min诱导表达5 h后，收集菌液并处理样品［12］.对处理后的样品进行SDS－PAGE分析.收集表达细菌，6 000r/min离心10 min后称重.1 g细菌量用20 mL的缓冲液PBS重悬.混匀后超声破碎细胞超声5 s，间隙5 s，10 min后6 000 r/min室温离心10 min.再用20 mL的漂洗缓冲液（2 mol/L尿素，质量分数0．5%曲拉通，1 mmol/L EDTA）重悬后混匀将得到的较纯净的Gp64蛋白染色后点样，大概点样500μL，将得到的胶块考马斯亮蓝染色15 min.脱色过夜至蛋白胶无蛋白位置无色.将目的蛋白所在的区域用洁净的小刀切下来，装入处理好的透析袋中，加入1 mL Tris－Gly缓冲液，置4℃30 min.取事先放置在4℃的Tris－Gly缓冲液加入到核酸电泳仪，将含有目的蛋白的透析袋放入，电泳2～3 h，每间隔1 h更换预冷的缓冲液.电泳结束后，将透析袋放入pH8．0的PBS缓冲液中透析过夜.透析结束后，取透析液蛋白电泳分析纯化结果［13］.

1.2.5 抗Gp64蛋白抗体制备及特异性检测以Gp64蛋白为抗原，进行大白兔免疫实验.汲取1 mL蛋白溶液（400~600 ng/mL）对大白兔进行双腿静脉注射.在饲养间隔14 d和28 d后进行第1次和第2次加强针注射.继续培养11 d后取静脉血，收集抗体进行抗体利用蛋白印记进行特异性检测.其中特异性一抗1∶4 000进行稀释.羊抗兔二抗1∶8 000进行稀释.

2 结果和分析

2.1 重组质粒pET28a－Gp64的构建

图1、2为重组质粒pET28a－Gp64的构建的电泳图.

图1 全长和截短Gp64DNA序列PCR电泳图Fig.1 PCR-Electrophoreses about Gp64 and truncate Gp64 DNA sequence

图2 Gp64和pET28a凝胶回收后电泳图Fig.2 Electrophoreses after gel extraction about Gp64 and pET28a

PCR后通过电泳得到截短Gp64DNA图，结果显示与预期结果相同，在1 000 bp左右位置有亮带.所需要的目的DNA经过凝胶电泳纯化，通过DNA电泳可知纯化得到的较纯净的DNA，用于做连接反应，目的在于增加连接效率.

2.2 重组质粒PCR检测和酶切检测

挑选3个重组子做菌落PCR检测，其结果如图3所示，都能扩增出很明显的目的片段.然后，将选择1、2号进一步进行酶切检测，分别采用EcoRV和EcoRI双酶切，EcoRI和EcoRV单酶切.根据质粒图谱分析重组子采用EcoRI和EcoRV单酶切出现6 300 bp左右条带；采用EcoRV和EcoRI双酶切出现1 381 bp和4 914 bp条带.选择正确的重组子进行测序检测，捕获所需要的目的重组子.

2.3 目的蛋白的表达及纯化

通过诱导实验，对样品进行相同处理后，采用质量分数12%SDS－PAGE电泳图得到如下图5所示，其中加入诱导剂进行诱导的菌种在29~44 kD之间明显产生大量的蛋白质，与理论上目的蛋白40 kD相符合.所以目的蛋白成功诱导表达.图6显示，经过电透析纯化的蛋白纯度较高，符合下一步实验的要求.

2.4 抗体的制备及特异性检测

利用制备的抗体进行WB实验结果如下图所示，其中检测抗原为电透析纯化的Gp64蛋白.图7说明制备的抗体具有识别Gp64蛋白能力，该图中抗原按照一定的稀释度点样，当样品量高时，得到的条带不单一表明抗体的纯度不高.由于免疫试验所提供的蛋白纯度不够，杂蛋白对抗体的特异性有一定的影响.可以利用电透析纯化的目的蛋白对所制备的抗体进行纯化，增加抗体的特异性.

图3 PCR检测重组子电泳图片Fig.3 PCR electrophoreses about recombination bacterial colony

图4 酶切检测重组子电泳图片Fig.4 Electrophoreses about recombination DNA

图5 目的蛋白诱导表达Fig.5 Expression about purpose protein

图6 目的蛋白纯化图片Fig.6 Purification about purpose protein

图7 蛋白印迹Fig.7 Western Blot

3 讨论

Gp64蛋白是核型多角体病毒囊膜上的一个经糖基化修饰的功能蛋白，在病毒入侵宿主细胞和出芽型病毒转运过程中都起重要作用［14］.为了进一步研究杆状病毒Gp64蛋白在病毒感染宿主过程表达检测及寻找其相互作用蛋白，制备高效价的抗Gp64蛋白抗体是极为重要的一步.我们对Gp64基因的完整读码框进行扩增，并将构建的重组载体导入BL21（DE3）表达菌，多次对诱导条件进行摸索，同时更换表达菌等尝试无法获得原核表达的Gp64蛋白（结果未显示）.分析原因可能是Gp64蛋白为囊膜蛋白，它的跨膜区域会阻止蛋白质的折叠，从而影响目的蛋白的合成［10－11］；其次稀有密码子对蛋白翻译的影响，目标蛋白跨膜区域周围存在较多的稀有密码子，在翻译时出现了翻译障碍导致蛋白合成终止而无法正常合成目的蛋白［9］.通过分析，切除其跨膜区域后，将重新构建的重组子导入到BL21表达菌中实现了Gp64截短蛋白基因在大肠杆菌中的表达.对表达的蛋白进行电透析纯化.其中使用6×His标签进行纯化，但是表达的蛋白为包涵体蛋白，在洗涤变性过程中，高盐浓度对于镍柱吸附效率影响很大，纯化量及纯度远远达不到要求（结果未显示），故采用电透析纯化.利用该蛋白进行大白兔免疫实验得到了特异性结合Gp64蛋白的抗体，为Gp64蛋白后续的表达检测及研究其相互作用的蛋白奠定了基础.

致谢

感谢湖北省科技厅的资助！

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Prokaryotic expression of Autographa californica multiple nucleopolyhedro virus Gp64 gene

ZHANG You－hong1，2，XIONG Yao1，2，ZHOU Feng1，2，XU Zhi－peng1，2，CHEN Jie1，2，CHEN Xing－zhou1，2
1.School of Chemical Engineering＆Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；2.Key Laboratory for Green Chemical Process（Wuhan Institute of Technology），Ministry of Education，Wuhan 430074，China

Gp64 protein is one of important function proteins in baculovirus virion during infectious process．Specific primers were designed by Oligo6．0 to amplify and purify a truncated fragment of silk wormautographa californicamultiple nucleopolyhedro virus Gp64 gene with polymerase chain reaction The purified target DNA fragment was subjected to double enzymatic digestion withEcoRⅠandXhoⅠwhile prokaryotic expression vector pET28a was cut byEcoRI andSalI，then the ligation between the two products was carried out；E．coliBL21（DE3）cells that had caught the recombinant plasmid pET28a－GpP64 were induced with isopropyl－β－D－thiogalactoside，the induced product was then analyzed with SDS－PAGE．And the results show that the amplified target is expressed.The protein was purified by electro dialysis，which makes for the preparation of anti Gp64 antibody．

AcMNPV；Gp64 protein；Gp64 gene；expression；purification

Q71

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.07.003

1674－2869（2015）07－0011－05

本文编辑：张瑞

2015－03－30

湖北省自然科学重点基金（2013CFA101）

作者介绍：张佑红（1964－），男，湖南浏阳人，教授，博士研究生导师．研究方向：基因工程.