浸矿微生物生物膜的形成与调控研究现状

孙 慧，谷亚冰，马丽媛，肖云花，梁伊丽，刘学端

（1．中南大学 生物冶金教育部重点实验室，湖南 长沙 410083；2．中南大学 资源加工与生物工程学院，湖南 长沙 410083）

我国有色金属矿产资源品位低，组成复杂，难于处理，常规选冶成本较高，易造成环境污染等问题。生物冶金技术可以利用微生物将硫化矿等矿物中的非水溶性有价金属转变成可溶形式加以回收，是低品位硫化矿选冶的重要技术［1］。

生物冶金系统中，微生物的作用有非接触机制和接触机制。非接触机制是指浮游细菌将浸出体系或硫化矿氧化过程中产生的Fe2＋氧化成Fe3＋，Fe3＋作为强氧化剂进一步氧化分解硫化矿，从而浸出有价金属；而接触机制是指浸矿微生物吸附于矿物表面，产生相关的酶（如铁氧化酶和硫氧化酶），直接将硫化矿氧化分解为金属离子和硫，细菌进一步将硫氧化为硫酸［2］。研究发现，生物浸出过程中，微生物及其分泌的胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS）以生物膜的形式吸附在矿物表面，营造自身生长的微环境，在有价金属浸出过程中发挥重要作用［3］。

生物膜是与浮游生长相对应的一种生长方式。生物膜内的细胞相互协调，以多细胞群体形式组成复杂结构，其形成是十分复杂的生物学、化学过程，且受环境因素影响［4］。对生物冶金体系中生物膜的形成及其与矿物之间的作用机制的研究尚处于起步阶段。本文综述了近年来生物冶金体系中生物膜的组成、生物膜的形成过程及与矿物浸出的关系，以及生物膜调控机制方面的最新进展。

1 浸矿微生物生物膜的组成

生物冶金体系中，吸附在矿物表面的微生物本身及其分泌的EPS，以及部分浸出产物如单质硫、非水溶性多硫化合物、铁矾、硫酸铅等在矿物表面与溶液之间组成生物膜［5-6］。生物膜中的胞外多聚物主要包括多糖、蛋白质、核酸和脂类，它们介导微生物矿物表面的附着，形成一个具有三维结构的聚合物网络，保证生物膜的机械稳定性；此外，作为一个外部消化系统，胞外多聚物使胞外酶能够接近细胞，代谢可溶性、胶体或固体的生物物质［7］。

近年来，随着荧光标记、共聚焦激光扫描显微镜、原子力显微镜、基因组学和蛋白组学等新兴技术的发展，浸矿菌中新的生物膜组分相继被发现［8］。S．Bellenberg等［9］利用荧光标记的伴刀豆凝集素发现以亚铁为能源培养的acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270生物膜中含少量的荚膜多糖（capsular polysaccharides，CPS），将细菌转移到黄铁矿中培养，24h后产生大量CPS。在培养基中补充葡萄糖或半乳糖可以诱导细胞产生CPS，而酪蛋白氨基酸不能诱导产生CPS［9］。蛋白组学研究发现，acidithiobacillus thiooxidans生物膜中含有一种新的脂蛋白licanantase，该蛋白属于OMP40类蛋白，能够促使细胞吸附到矿物表面的疏水区域，参与电子传递，有利于细菌定植和氧化矿物［10］。以硫为能源培养 A．ferrooxidans细胞，蛋白组学技术分析表明，EPS中的蛋白质含有丰富的巯基和CXXC结构域，可以通过Pr-SH与硫元素结合，直接参与对硫的代谢。近年来，在多种微生物中发现一种类似菌毛的蛋白质细丝——纳米线。纳米线是生物膜的重要组分，具有独特的胞外电子转移能力。A．ferrooxidans的Ⅳ型菌毛（TFP）具有导电能力，电子经氧化还原蛋白之间的电子传递反应沿TFP传导，在矿物、可溶性电子传递中间体和外膜细胞色素间形成电流，加快生物膜上电子传递速率，形成细胞表面和Fe（Ⅱ）氧化物之间的电子传递通路。TFP的结构域蛋白由保守氨基酸序列组成，有2个基因pilV和pilW编码。pilV是吸附基因，而pilW是用于编码TFP的主要蛋白质［11-14］。

浸矿微生物的胞外多聚物主要由中性糖、糖醛酸和脂肪酸组成，由于生长基质、菌种类型及培养时间不同，生物膜的组成和含量也不同［15］。由亚铁或黄铁矿培养的A．ferrooxidans和leptospirillum ferrooxidans等铁氧化菌的EPS中普遍存在岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖和糖醛酸；而以硫为能源培养的浸矿微生物，如A．thiooxidans的EPS中糖的含量相对较少，主要成分是葡萄糖，且未检测到糖醛酸［15］。生物膜中脂类物质主要为脂多糖、脂肪酸和脂蛋白，脂多糖在培养中期较多，脂肪酸的主要成分包括二十二烷酸、十八烷酸和十六烷酸等［2-3］。此外，在含铁能源培养的微生物胞外多聚物中检测到三价铁离子，糖醛酸等胞外多聚物通过络合铁离子影响界面浸出过程。分别以A．ferrooxidans、L．ferrooxidans和 L．ferriphilum氧化黄铁矿，发现EPS中铁含量与氧化活性成正比［16-18］。

2 生物膜的形成与矿物浸出

浸矿微生物能分泌各种胞外物质，通过形成生物膜吸附在矿物表面，形成一个10～100nm的反应空间，使矿物逐步溶解［18］。细菌生物膜增殖的程度及其吸附率与生物膜的活性紧密相关［16，19］。

用原子力显微镜、拉曼光谱和荧光标记技术对黄铁矿浸出时生物膜的状况的研究表明，浸矿微生物形成单层生物膜，培养初期细胞开始吸附到矿物表面，吸附力是弱的非共价作用力；浸出中期吸附的细胞数量达到最大值；后期随着生物氧化时间增加，矿物表面生物膜逐渐减少。结果显示，在黄铁矿表面生物氧化S0的过程中，细菌分泌较多的EPS，而EPS紧密吸附在黄铁矿表面，Fe（Ⅲ）通过接触机制氧化矿物，这表明EPS在微生物和矿物表面相互作用中扮演重要角色［20-21］。

对黄铜矿表面及溶液中微生物的分布规律的研究表明：生物浸出前期，生物膜通过富集铁离子氧化分解矿物；浸出中期，当生物膜的量达到最大时，溶液中的游离微生物大量生长，促进铁的氧化还原和可溶性硫的氧化；浸出后期，黄钾铁矾的形成抑制矿物表面微生物和营养物的流动及相应的反 应，从而阻碍黄铜矿的浸 出［22-25］。N．A．Olivera等［26］首次利用二维不均匀的生物膜模型研究生物浸出时的生化反应，结果表明，随浸出的进行，矿物表面形成不渗透固体层，这个固体钝化层阻碍 O2、CO2、Cu2＋和Fe2＋的扩散，而这些物质决定细菌和矿物反应的动力学。化能自养微生物形成的生物膜能够通过形成腐蚀坑、硫溶解增加固体层孔隙率来延迟钝化。与较厚的生物膜相比，平坦的生物膜更有利于生物浸出，因它更利于硫的溶解而不是铁的氧化。

在生物浸矿过程中，矿物表面的形态转化诱导生物膜的结构变化。J．V．García-Meza等［27］利用拉曼光谱、EPS生化分析和荧光显像技术研究了A．thiooxidans氧化块状黄铜矿电极（massive chalcopyrite electrodes，MCE）过程中矿物表面Sn2-／S0的动态变化和生物膜的转变。最初，MCE的表面包含具有活性的二级Sn2-和S0的混合物，微生物形成厚的单层生物膜。随着细菌对S0／Sn2-的不断氧化，矿物表面形成稳定的CuS和S0簇状物，而生物膜中脂质和蛋白质逐渐增多，降低了细胞和矿物表面的界面张力，克服细胞与矿物表面间的屏障，有利于细胞和矿物直接接触进行氧化反应，这为后期生物膜的分层提供了有利条件。

3 浸矿微生物生物膜的调控

生物膜是细胞间相互协调，以多细胞群体形式组成的复杂结构，它的形成受环境因子、细胞密度和信号分子的调控。

群体感应（quorum sensing，QS）是依赖细胞密度的一种细胞间的信号机制，由可扩散的自诱导物（autoinducers，AIs）介导细胞间的信号传递，可与影响生物膜结构的因素相互作用，影响生物膜的形成和功能。薄层色谱法分析结果表明，A．ferrooxidans和A．thiooxidans菌株都能够产生酰基高丝氨酸内酯 （acyl-homoserine lactone，AHL）信号分子，但L．ferrooxidans菌株不能。AHL具有不同长度的酰基链，AHL混合物抑制细胞吸附到黄铁矿等矿物表面，而具有长酰基链（12或14个碳）的单一信号分子可以增强吸附。这些发现有利于控制酸性矿山废水（AMD）污染和改善生物浸矿过程，为研究生物冶金开拓了新的视角［28］。

与其他革兰氏阴性菌一样，A．ferrooxidans的官能团AI-1型QS系统由4个分子元件组成：AHL合成酶（由AfeI编码），结合信号分子的转录调控因子（AfeR），二元配合物［AfeR-AHL］作用的Afe-盒，不同的高丝氨酸内酯（AHL）信号分子［29］。当细菌密度或营养条件变化时，AfeI就会合成AHL信号分子，这些分子具有不同的C-3基团（氧或羟基），其酰基链中碳原子数为8～16个。AfeR基因和群体感应调节蛋白能够识别具有不同长度酰基链的信号分子。信号分子随细菌数目的增加而增加，达到一定浓度后，细菌细胞内外就会感知并引发一系列反应，调节生物膜的形成［30-31］。此外，相比于铁培养的细胞，在高能固体底物如硫中生长的细胞，AfeI基因具有更高的转录水平［32-33］。

除 AHL信号分子外，A．ferrooxidans ATCC 23270具有编码第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）相关的酶系，调控生物膜的形成和胞外多糖的生成［34］。环二鸟苷酸（c-di-GMP）在细胞中的量取决于二鸟苷酸环化酶（DGCS，具有GGDEF结构域）和磷酸二酯酶（PDE，具有EAL或 HD-GYP结构域）的活性。A．ferrooxidans ATCC 23270的基因组序列分析确定了5个编码DGC和PDE——类似蛋白的开放阅读框：其中，AFE＿0053，AFE＿1360，AFE＿1373和 AFE＿1379具有GGDEF和EAL结构域，编码双功能蛋白；AFE＿1852只有一个EAL结构域［35］。A．ferrooxidans生物膜细胞中c-di-GMP的量明显高于浮游细胞，其浸矿效率也更高。此外，与亚铁中浮游细胞相比，吸附在硫铁矿表面的细胞的c-di-GMP水平更高，说明具有GGDEF／EAL结构域的蛋白在铁氧化菌的生物膜中优先表达［36］。

4 展望

生物膜是微生物营造自身生长微环境的主要物质，在完善生物膜组分的基础上，深入研究各种浸矿微生物生物膜的特性、生物膜形成与细胞结构变化、细胞代谢过程及浸矿环境参数之间的动态联系，可逐步了解微生物浸矿规律。随着生物技术的快速发展，在基因组学、转录组学、蛋白质组学等水平上研究生物膜的形成与调控机制，建立有效消除钝化膜的关键技术，对提高生物冶金细菌浸出速率和金属回收率有重要意义。

［1］Takakuwa S，Fujimori T，Iwasaki H．Some Properties of Cell-sulfur Adhesion in Thiobacillus Thiooxidans［J］．Journal of General Applied Microbiology，1979，25：21-29．

［2］Sand W，Gehrke T．Extracellular Polymeric Substances Mediate Bioleaching via Interfacial Processes Involving Iron（Ⅲ）Ions and Acidophilic Bacteria［J］．Research in Microbiology，2006，157（1）：49-56．

［3］Zeng W M，Qiu G Z，Zhou H B，et al．Characterization of Extracellular Polymeric Substances Extracted During the Bioleaching of Chalcopyrite Concentrate［J］．Hydrometallurgy，2010，100（3）：177-180．

［4］Liang Y，Gao H，Chen J，et al．Pellicle Formation in Shewanella Oneidensis［J］．BMC Microbiology，2010，10（1）：291-301．

［5］Sampson M I，Phillips C V，Blake R C．Influence of the Attachment of Acidophilic Bacteria During the Oxidation of Mineral Sulfides［J］．Minerals Engineering，2000，13（4）：373-389．

［6］Sand W，Gehrke T．Extracellular Polymeric Substances Mediate Bioleaching via Interfacial Processes Involving Iron（Ⅲ）Ions and Acidophilic Bacteria［J］．Research in Microbiology，2006，157（1）：49-56．

［7］Flemming H C，Wingender J．The Biofilm Matrix［J］．Nature Reviews Microbiology，2010，8（9）：623-633．

［8］Jerez C A．The Use of Genomics，Proteomics and Other OMICS Technologies for the Global Understanding of Bio-mining Microorganisms［J］．Hydrometallurgy，2008，94（1）：162-169．

［9］Bellenberg S，Leon-Morales C F，Sand W，et al．Visualization of Capsular Polysaccharide Induction in Acidithiobacillus Ferrooxidans［J］．Hydrometallurgy，2012，129：82-89．

［10］Fazzini R A B，Levican G，Parada P．Acidithiobacillus Thiooxidans Secretome Containing A Newly Described Lipoprotein Licanantase Enhances Chalcopyrite Bioleaching Rate［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2011，89（3）：771-780．

［11］Strycharz-Glaven S M，Snider R M，Guiseppi-Elie A，et al．On the Electrical Conductivity of Microbial Nanowires and Biofilms［J］．Energy ＆ Environmental Science，2011，4（11）：4366-4379．

［12］El-Naggar M Y，Wanger G，Leung K M，et al．Electrical Transport along Bacterial Nanowires From Shewanella Oneidensis MR-1［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，2010，107（42）：18127-18131．

［13］Nielsen L P，Risgaard-Petersen N，Fossing H，et al．Electric Currents Couple Spatially Separated Biogeochemical Processes in Marine Sediment［J］．Nature，2010，463（7284）：1071-1074．

［14］Li Y，Li H．TypeⅣ Pili of Acidithiobacillus Ferrooxidans Can Transfer Electrons From Extracellular Electron Donors［J］．Journal of Basic Microbiology，2014，54（3）：226-231．

［15］Harneit K，G ksel A，Kock D，et al．Adhesion to Metal Sulfide Surfaces by Cells of Acidithiobacillus Ferrooxidans，Acidithiobacillus Thiooxidans and Leptospirillum Ferrooxidans［J］．Hydrometallurgy，2006，83（1）：245-254．

［16］Africa C J，van Hille R P，Sand W，et al．Investigation and in Situ Visualisation of Interfacial Interactions of Thermophilic Microorganisms With Metal-sulphides in A Simulated Heap Environment［J］．Minerals Engineering，2013，48：100-107．

［17］Kinzler K，Gehrke T，Telegdi J，et al．Bioleaching：A Result of Interfacial Processes Caused by Extracellular Polymeric Substances（EPS）［J］．Hydrometallurgy，2003，71（1）：83-88．

［18］Vera M，Schippers A，Sand W．Progress in Bioleaching：Fundamentals and Mechanisms of Bacterial Metal Sulfide Oxidation：Part A［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（17）：7529-7541．

［19］Africa C J，Harrison S T L，Becker M，et al．In Situ Investigation and Visualisation of Microbial Attachment and Colonisation in A Heap Bioleach Environment：The Novel Biofilm Reactor［J］．Minerals Engineering，2010，23（6）：486-491．

［20］González D M，Lara R H，Alvarado K N，et al．Evolution of Biofilms During the Colonization Process of Pyrite by Acidithiobacillus Thiooxidans［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2012，93（2）：763-775．

［21］Lara R H，Valdez-Pérez D，Rodr Guez A G，et al．Interfacial Insights of Pyrite Colonized by Acidithiobacillus Thiooxidans Cells Under Acidic Conditions［J］．Hydrometallurgy，2010，103（1）：35-44．

［22］Devasia P，Natarajan K A，Sathyanarayana D N，et al．Surface Chemistry of Thiobacillus Ferrooxidans Relevant to Adhesion on Mineral Surfaces［J］．Applied and Environmental Microbiology，1993，59（12）：4051-4055．

［23］Crundwell F K．How do Bacteria Interact With Minerals［J］．Hydrometallurgy，2003，71（1）：75-81．

［24］Beech I B，Sunner J．Biocorrosion：Towards Understanding Interactions Between Biofilms and Metals［J］．Current O-pinion in Biotechnology，2004，15（3）：181-186．

［25］Zeng W，Tan S，Chen M，et al．Detection and Analysis of Attached Microorganisms on the Mineral Surface During Bioleaching of Pure Chalcopyrite With Moderate Thermophiles［J］．Hydrometallurgy，2011，106（1）：46-50．

［26］Olivera N A，Picioreanu C，Asenjo J A．Non-homogeneous Biofilm Modeling Applied to Bioleaching Processes［J］．Biotechnology and Bioengineering，2010，106（4）：660-676．

［27］García-Meza J V，Fernández J J，Lara R H，et al．Changes in Biofilm Structure During the Colonization of Chalcopyrite by Acidithiobacillus Thiooxidans［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（13）：6065-6075．

［28］Ruíz L M，Valenzuela S，Castro M，et al．AHL Communication is A Widespread Phenomenon in Biomining Bacteria and Seems to be Involved in Mineral-adhesion Efficiency［J］．Hydrometallurgy，2008，94（1）：133-137．

［29］González A，Bellenberg S，Mamani S，et al．AHL Signaling Molecules With A Large Acyl Chain Enhance Biofilm Formation on Sulfur and Metal Sulfides by the Bioleaching Bacterium Acidithiobacillus Ferrooxidans［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（8）：3729-3737．

［30］Davies D G，Parsek M R，Pearson J P，et al．The Involvement of Cell-to-cell Signals in the Development of A Bacterial Biofilm［J］．Science，1998，280（5361）：295-298．

［31］Hardie K R，Heurlier K．Establishing Bacterial Communities by＇Word of Mouth＇：LuxS and Autoinducer 2in Biofilm Development［J］．Nature Reviews Microbiology，2008，6（8）：635-643．

［32］Ruíz L M，Gonzalez A，Frezza M，et al．Is the Quorum Sensing Type AI-1System of Acidithiobacillus Ferrooxidans Involved in Its Attachment to Mineral Surfaces［J］．Advanced Materials Research，2007，20／21：345-349．

［33］González A，Bellenberg S，Mamani S，et al．AHL Signaling Molecules With A Large Acyl Chain Enhance Biofilm Formation on Sulfur and Metal Sulfides by the Bioleaching Bacterium Acidithiobacillus Ferrooxidans［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（8）：3729-3737．

［34］Ruíz L M，Castro M，Barriga A，et al．The Extremophile Acidithiobacillus Ferrooxidans Possesses A c-di-GMP Signalling Pathway That Could Play A Significant Role During Bioleaching of Minerals［J］．Letters in Applied Microbiology，2012，54（2）：133-139．

［35］Ruíz L M，Sand W，Jerez C A，et al．C-di-GMP Pathway in Acidithiobacillus Ferrooxidans： Analysis of Putative Diguanylate Cyclases （DGCs）and Phosphodiesterases（PDEs）Bifunctional Proteins［J］．Advanced Materials Research，2007，20／21：551-555．

［36］Ruíz L M，Castro M，Barriga A，et al．The Extremophile Acidithiobacillus Ferrooxidans Possesses A C-di-GMP Signalling Pathway That Could Play A Significant Role during Bioleaching of Minerals［J］．Letters in Applied Microbiology，2012，54（2）：133-139．