系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞微小RNA-206表达水平

徐庆雷，朱宝林，马小波，张　巍，刘玲玲，王胜军

(沭阳县人民医院检验科，江苏沭阳 223600)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种可累及多器官、多系统的慢性自身免疫性疾病，受累人群常为青年女性，其免疫学特征为患者血清中出现多种自身抗体和自身反应性CD4+T细胞数量增高[1]。辅助T(helper T，Th)细胞17(Th17细胞)是近年来新命名的一类辅助性CD4+T细胞亚群，其具有独特的分化途径和转录因子——孤儿核受体γt(orphan nuclear receptor γt，RORγt)，且以分泌白细胞介素(interleukin，IL)17为特征[2]。研究表明，Th17细胞在SLE的发生发展中起重要作用[3- 4]。锌指样转录因子4(Kruppel-like transcription factor 4，KLF4)是Th17细胞分化的正调节因子[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)(约20～22个核苷酸)为非编码RNA，可介导RNA干扰和在翻译水平抑制蛋白表达，人类KLF4是miRNA-206的靶分子之一[6]。

本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测SLE患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)miRNA-206和KLF4 及RORγt mRNA表达水平，并分析其与KLF4、RORγt mRNA表达的相关性，探讨miRNA-206在SLE发病中的作用机制。

资料和方法

研究对象和分组

选择2012年12月至2013年11月在沭阳县人民医院确诊的SLE患者，入选病例均符合美国风湿病协会(American College of Rheumatology，ACR)1997年修订的SLE分类诊断标准[7]。排除伴有心力衰竭、呼吸衰竭、严重肝肾功能损害、严重感染、肿瘤及其他自身免疫病等情况。病情活动性评估采用SLE病情活动评分(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)，即2000评分法[8]。 SLEDAI≤9分纳入SLE非活动组，SLEDAI>9分纳入SLE活动组。健康对照组选择沭阳县人民医院体检中心健康体检志愿者，且均无近期感染或自身免疫病史。

仪器与试剂

实时荧光PCR仪为CFX 96型，Ficoll-Hypaque人淋巴细胞分离液购自天津灏阳生物制品有限公司，淋巴细胞刺激剂佛波酯(PMA)、离子霉素购自Sigma公司，PCR引物由上海生工合成，Trizaol和SYBR Green购自Invitrogen公司。

方法

标本采集和处理：抽取清晨空腹肘静脉血3～5 ml，肝素钠抗凝，随后用Ficoll-Hypaque人淋巴细胞分离液梯度离心得到PBMC，PBS液洗2次，调整细胞数为1×106/ml，加入24孔细胞培养板，于含有淋巴细胞刺激剂佛波酯(50 ng/ml)和离子霉素(1.0 μg/ml)RPMI 1640完全培养基中37℃、5%CO2饱和湿度条件下温育5 h后收集细胞。

KLF4和RORγt mRNA及miRNA-206相对表达量检测：采用上述方法将PBMC刺激5 h后收集细胞提取总mRNA。按照试剂盒说明书逆转录DNA，合成的cDNA存于-20℃冰箱备用。所用引物序列依次为KLF4上游引物5’-CAA GTC CCG CCGCTC CAT TAC CAA-3’，下游引物5’-CCA CAG CCG TCCCAG TCA CAG TGG-3’；RORγt上游引物5’-CCTGGGCTCCTCG CCTGACC-3’，下游引物5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCT TGCC-3’；β-actin上游引物5’-CACGA AACTACCTT CAACTCC-3’，下游引物为5’-CATACTCCTGCT TGCTGATC-3’。以β-actin为参照校准。miRNA-206上游引物为5’-GAGTGCTGGAATGTAAGGAAG-3’，下游引物为5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，以U6小核RNA(small nuclear-RNA，snRNA)为内参照。每份样本采用相同反应体系及条件同时进行PCR扩增3次。

统计学分析

结　　果

一般资料

共纳入SLE患者27例，其中男5例，女22例，平均年龄为(38±11)岁。SLE非活动组12例，SLE活动组15例。健康对照组20例，其中男4例，女16例，平均年龄为(35±8)岁。各组性别、年龄差异无统计学意义。

KLF4和RORγtmRNA及miRNA-206表达水平比较

SLE患者PBMC中KLF4和RORγt mRNA相对表达量显著高于健康对照组，差异均有统计学意义(均P<0.01)，而miRNA-206相对表达量显著低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。

SLE活动组PBMC中KLF4和RORγt mRNA表达水平显著高于SLE非活动组，差异均有统计学意义(均P<0.01)，而miRNA-206相对表达量显著低于非活动组，差异有统计学意义(P<0.01)(表2)。

表1两组外周血单个核细胞中锌指样转录因子4和孤儿核受体γt mRNA及微小RNA-206表达水平比较

组别锌指样转录因子4mRNA孤儿核受体γtmRNA微小RNA⁃206健康对照组0 104±0 0280 065±0 0140 143±0 059SLE0 637±0 1860 575±0 2630 066±0 021t值6 6737 3863 136P值<0 01<0 01<0 01

SLE：系统性红斑狼疮

表2两组系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中锌指样转录因子4和孤儿核受体γt mRNA及微小RNA-206表达水平比较

组别锌指样转录因子4mRNA孤儿核受体γtmRNA微小RNA⁃206非活动SLE组0 131±0 0560 094±0 0190 125±0 038活动SLE组0 973±0 2310 968±0 3160 034±0 015t值8 5039 1863 896P值<0 01<0 01<0 01

SLE：系统性红斑狼疮

相关性分析

SLE患者PBMC中KLF4和RORγt mRNA与SLEDAI呈正相关(P<0.01)，而miR-206与SLEDAI评分呈负相关(P<0.01)(表3)。

直线相关分析显示，KLF4和RORγt mRNA相对表达量呈正相关(r=0.684，P<0.01)(图1)。

直线相关分析显示，miRNA-206与KLF4和RORγt mRNA表达水平均呈负相关(r=-0.627，P<0.01；r=-0.853，P<0.01)(图2、3)。

讨　　论

SLE发病的确切机制尚不明了，研究证实T细胞免疫异常起着非常重要的作用，且与疾病发生发展和预后有很大关系。Th17细胞是一类不同于Th1和Th2的CD4+T细胞新亚群，此类细胞以主要分泌IL-17得名。RORγt是Th17细胞特异性转录因子，可调控IL-17的分泌[2]。研究表明，Th17细胞及其相关细胞因子在SLE的发病过程中发挥了重要作用[3- 4]。Wong等[9]报道，SLE患者外周血Th17细胞显著升高，且与疾病活动度呈正相关。本研究发现，SLE患者外周血Th17细胞的特异性转录因子RORγt mRNA的表达显著增高，与SLEDAI呈显著正相关(r=0.719，P<0.01)，说明RORγt mRNA升高与SLE的发生及活动性密切相关。另外，本研究将SLE患者按疾病活动度分为活动组与非活动组后比较发现，SLE活动组RORγt mRNA显著高于SLE非活动组和健康对照组，而SLE非活动组与健康对照组之间差异无统计学意义，提示RORγt mRNA水平高低可反映SLE疾病的活动性。

表3　系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中锌指样转录因子4和孤儿核受体γt mRNA及微小RNA-206表达水平与病情活动评分相关性分析

图1系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中锌指样转录因子4和孤儿核受体γt mRNA表达相关性分析

Fig1Correlation analysis between the expression levels of Kruppel-like factor 4 and orphan nuclear receptor γt in peripheral blood mononuclear cells in patients with systemic lupus erythematosus

图2系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中微小RNA-206与锌指样转录因子4 mRNA相关性分析

Fig2Correlation analysis between the expression levels of Kruppel-like factor 4 and microRNA-206 in peripheral blood mononuclear cells in patients with systemic lupus erythematosus

图3系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中微小RNA-206与孤儿核受体γt mRNA相关性分析

Fig3Correlation analysis between orphan nuclear receptor γt and microRNA-206 in peripheral blood mononuclear cells in patients with systemic lupus erythematosus

KLF家族是真核生物中一大类基础转录因子(basic transcription element-binding protein，BTEB)[10]，KLF4则为其家族中的一员。KLF4包含3个结构域，即高度保守的C-端DNA结合结构域，高度可变的N-端转录调节结构域和核定位序列[11]。KLF4能结合靶基因富含Gc的启动子序列，促进或抑制靶基因的表达；且对Th17细胞分化具有正调节作用[5]。本研究结果示，SLE患者PBMC中KLF4 mRNA表达显著增高，且与RORγt mRNA表达呈正相关(r=0.684，P<0.01)；提示SLE患者PBMC中KLF4 mRNA可以上调RORγt mRNA表达，促进Th17细胞分化。此外，本研究将SLE患者按疾病活动进一步分组发现，SLE活动组KLF4 mRNA显著高于SLE非活动组与健康对照组，与上述SLE活动组RORγt mRNA显著高于SLE非活动组与健康对照组结果一致，验证了KLF4 mRNA是调控Th17细胞重要因子的结论。

miRNA是一类内源性小分子RNA，其常规作用方式是通过与靶基因的3’UTR结合抑制靶基因的表达[12]。人类KLF4是miRNA-206的靶分子之一，miRNA-206对KLF4的表达具有抑制作用[6]。本研究发现，SLE患者PBMC中miRNA-206表达下降而KLF4 mRNA表达水平升高，两者呈负相关(r=-0.627，P<0.01)，与其结果相符；SLE活动组miRNA-206显著低于SLE非活动组与健康对照组，miRNA-206与SLEDMI呈显著负相关(r=-0.654，P<0.01)，证实了活动期SLE患者体内miRNA-206减少。同时，本研究还发现，SLE患者PBMC中miRNA-206与RORγt mRNA表达也呈显著负相关(r=-0.853，P<0.01)，提示miRNA-206可能通过调节KLF4 mRNA的表达，参与调控Th17细胞。

SLE是一种异质性疾病，其发病机制复杂。本研究发现，SLE患者PBMC中miRNA-206、KLF4和RORγt mRNA表达存在显著异常，并与疾病活动性密切相关，提示这三者共同变化可能在SLE的发生发展中起重要作用，由此为SLE发病机制和治疗学的研究提供新思路。然而，其相关分子机制尚待进一步研究。

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