微生物冷休克蛋白的生理功能及其潜在应用

张 雪, 张华方, 刘 晴, 张宇微, 刘 波*

1.哈尔滨师范大学生命科学与技术学院, 哈尔滨 150025;

2.中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081;

3.北京市城市排水监测总站有限公司, 北京 100061;

4.浙江工商大学食品与生物工程学院, 杭州 310018

微生物冷休克蛋白的生理功能及其潜在应用

张 雪1,2§, 张华方3§, 刘 晴2,4, 张宇微2, 刘 波2*

1.哈尔滨师范大学生命科学与技术学院, 哈尔滨 150025;

2.中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081;

3.北京市城市排水监测总站有限公司, 北京 100061;

4.浙江工商大学食品与生物工程学院, 杭州 310018

冷休克反应是普遍存在于微生物体内的一种适应环境温度骤降的应答机制，而氨基酸序列高度保守的冷休克蛋白则是调控冷休克反应的重要因子。越来越多的研究表明，冷休克蛋白除了调控冷休克反应外，还参与调控了生物体多个性状，如宿主正常生长和分化、病原菌的侵袭力和致病性以及宿主对多种逆境(高渗透压、抗生素)的应答。综述了冷休克蛋白及其来源、其参与调控的生理性状和基于冷休克反应及冷休克蛋白的应用，以期为发酵条件优化、食品储藏、致病菌抑制以及作物性状改良等方面提供有益参考。

冷休克反应;冷休克蛋白;生理功能;逆境

环境因子(如温度、湿度、压力等)与生物体的生理状态甚至形态密切相关，其中环境温度急剧变化是生物体经常面临的胁迫，生物体随之进化出相应的生存机制来解除或适应胁迫。环境温度大幅降低时，生物经冷休克反应来调整蛋白表达模式以适应低温环境[1]。冷休克反应(cold shock response)是微生物乃至生物中普遍存在一种适应温度骤降及低温环境的生存机制，已在嗜热菌(Thermusthermophilus[2]，Thermotogamaritima[3]，Thermussp. GH5[4]，Thermoanaerobactertengcongensis[5])、中温菌(Lactobacilluscasei[6]，Bordetellabronchiseptica[7]，Caulobactercrescentus[8]，Bacillussubtilis[1])和低温菌(Psychromonasarctica[9]和Pseudoalteromonashaloplanktis[10])等众多微生物中发现了冷休克反应现象。目前，对大肠杆菌(Escherichiacoli)冷应激反应的研究最为深入。研究表明，环境温度由37℃降骤降至20℃以下时，指数生长期的Escherichiacoli呈现约3～6 h的冷休克反应期；在此阶段细胞生长停滞、多数蛋白停止表达，仅20多种蛋白仍持续表达[11,12]；其中蛋白CS7.4的表达量在短时间内提高了近200倍，被命名为冷休克蛋白CspA，并被认为是一种抗冻蛋白，保护细胞不受低温损伤[13]。本文就冷休克蛋白(cold shock protein, CSP)调控宿主适应低温和其他生境进行了概述，并对冷休克蛋白的应用进行了展望，以期为利用冷休克反应及冷休克蛋白的潜在价值提供一些思考和建议。

1 冷休克蛋白及其来源

在冷休克反应期间持续表达的蛋白称为冷诱导蛋白，其中与E.coliCspA氨基酸序列高度保守的一类蛋白称为冷休克蛋白。E.coli的CspA是最早揭示的冷休克蛋白，其在冷休克反应中的调控机制也得以较为详尽地阐明。CspA为含有70个氨基酸的酸性蛋白质，并形成5个反平行β折叠的β桶状片层结构，通过2个RNP-motifs结合mRNA以阻止mRNA在低温时形成稳定二级结构而促进特定蛋白的表达[14]。此外，E.coliCspA还充当以下元件：①抗转录终止子：增强低温适应相关的蛋白如NusA、IF2、RbfA 和PNP的表达[15]；②转录激活子:促进与低温适应性相关的蛋白，如DNA结合蛋白Hns和DNA异构酶GyrA的表达[16]。

据蛋白质的氨基酸序列一致性及蛋白性质分析发现：冷休克蛋白家族成员普遍存在于微生物中，在包括超嗜热菌、嗜热菌、中温菌和嗜冷菌等400种微生物中均有发现，其中来源于E.coli[17]、B.subtilis[1]、Neisseriameningitidis[16]、Salmonellatyphimurium[18]、T.maritima[19]的冷休克蛋白晶体结构已得到解析。另一方面，冷休克蛋白家族成员数目随微生物种类差异而不同，E.coli存在9个[13]，B.subtilis含有3个[20]，T.thermophilusHB8含有2个[2]，T.tengcongensisMB4含有1个[5]。目前，只在极少数微生物如Helicobacterpylori[21]、Campylobacterjejuni[22]和Mycoplasmagenitalium[23]的染色体上没有发现冷休克蛋白基因。冷休克反应和冷休克蛋白是普遍存在于生物体内的应激反应和应答响应因子，暗示了它们在生物体环境适应(如低温)方面扮演重要作用；另一方面，冷休克反应机制和冷休克蛋白参与调控的生理功能的阐明在理论研究和实际应用上有着积极意义。

2 冷休克蛋白参与调控的生理性状

2.1 冷休克蛋白与宿主对低温的适应性

冷休克蛋白在温度骤降的过程中显著表达，如E.coli、T.thermophilus的冷休克蛋白基因在冷激后短时间内转录水平均会显著提高[2,13]，合成的冷休克蛋白充当冷冻保护剂或调控其他与低温生存相关基因的表达。嗜热菌T.tengcongensisMB4染色体只有一个冷休克蛋白基因cspC，该基因的转录水平经50℃冷激1 h后提高了15.8倍，表明CspC参与了宿主的冷应激过程[5]。基因缺失和过表达实验进一步证实，冷休克蛋白在宿主低温适应过程中起着重要作用。4个冷休克蛋白基因(cspA、cspB、cspG、cspE)共缺失的E.coli会呈现低温敏感表型(在15℃时不能生长)，但这种表型可被任何表达过量的冷休克蛋白(除CspD)恢复。CspB是B.subtilis3个冷休克蛋白(CspB、CspC、CspD)中主要由低温诱导表达的冷休克蛋白，cspB缺失菌株的抗冻能力明显减弱，3个冷休克蛋白基因共缺失的菌株在低温时不能生长[24]。此外，cspB或cspC突变的ClostridiumbotulinumATCC 3502在15℃时几乎不能生长，20℃时生长速率只有野生型的30%；cspD突变的菌株在15℃和20℃时的生长速率分别是野生型的30%和20%[25]。过表达冷休克蛋白可提升宿主低温耐性，这从另一方面证实了冷休克蛋白对于宿主适应低温环境至关重要，如在E.coli中过表达P.articaKOPRI 22215的冷休克蛋白基因cspA后，E.coli对低温的耐性明显提高[9]。

2.2 冷休克蛋白与宿主的正常生长和分化

越来越多的研究结果表明，冷休克蛋白并不只参与宿主冷休克反应和低温胁迫，冷休克蛋白也为宿主正常生长和分化所必需。相关研究揭示，E.coliCspD能结合单链DNA，从而影响DNA复制。在快速生长时，E.coliCspD被迅速降解使得染色体复制快速进行；在稳定期、延迟期或碳源缺乏时， CspD大量表达并结合单链DNA，从而抑制了染色体的复制[26,27]，并促使E.coli形成存留细胞[28]。总体来讲，CspD表达量与宿主的生长速度呈负相关；在快速生长时，表达量低；生长停滞(如延迟期、稳定期、营养缺乏)时，表达量提升进而抑制染色体复制。此外，cspB和cspC双基因破坏的B.subtilis呈现拟核结构变异、稳定期细胞裂解、孢子形成丧失[29]。Balhesteros等[8]也揭示了CspC和CspD与稳定期细胞的活性相关；CspC在C.crescentus进入稳定期时表达，参与了C.crescentus的营养饥饿应激反应。进一步研究也发现，Janthinobacteriumsp.的CspD除了具有与大肠杆菌CspD相同的功能，还具有保护DNA免受紫外线损伤的功能[30,31]。

2.3 冷休克蛋白与宿主的致病性和侵袭力

Schärer等[32]发现，ListeriamonocytogenesCspB参与了宿主致病因子——溶胞素的合成，间接参与了该菌的致病性；缺失cspB后，L.monocytogenes致病能力减弱。此外，温度下降(37℃降至26℃)会增强病原菌Moraxellacatarrhali黏附素及致病因子UspA1的表达，进而增强黏附和致病能力[33]。Wang等[34]研究表明，cspA缺失的Brucellamelitensis在正常生长温度和低温时的生长速率和活性并无明显差异，但其致病能力显著降低。此外，CspR也与粪肠球菌侵袭力相关[35]。

由共同祖先经还原基因组进化而来的哺乳动物病原菌B.bronchiseptica、B.parapertussis、B.pertussis、鸟病原菌B.avium和自然环境中B.petrii虽然经历了不同的基因组简化，但这些菌体内均含有序列保守的冷休克蛋白基因，暗示了冷休克蛋白对宿主致病性非常重要[7]。

2.4 冷休克蛋白与宿主的抗药性

Staphylococcusaureus含有3个冷休克蛋白(CspA、CspB和CspC)，在甲氧苯青霉素抗性菌株中CspC表达量显著高于敏感菌株[36]，降低CspA的表达则会降低甲氧苯青霉素抗性菌株中色素合成并增强菌株对阳离子抗菌肽的抗性；cspB缺失的菌株生长缓慢，色素产量降低，对氨基糖甙类抗生素(gentamicin、amikacin和tobramycin)的抗性增加，对达托霉素(daptomycin)的抗性却降低[37]。

2.5 冷休克蛋白与宿主对高渗环境的应答

L.monocytogenes中3个冷休克蛋白CspA、CspB、CspD对宿主在最适生长温度(37℃)和正常渗透压下生存并非必需。然而，Schmid等[38]证实，3个冷休克蛋白对宿主的低温耐受性和渗透压耐受性至关重要。进一步研究发现，3个冷休克蛋白在宿主应对不同环境压力时重要性不同；应答低温低压力时，3个冷休克蛋白的重要性为CspA>CspD>CspB；低温高渗压力时，3个冷休克蛋白的重要性为CspD>CspA>CspB。此外，3个冷休克蛋白基因均缺失的L.monocytogenes在含2.2%的DMS高渗培养基中不能中生长。

3 基于冷休克反应及冷休克蛋白的应用

3.1 菌种保藏与发酵

在乳酸菌发酵过程中通常以冷冻菌体作为接种物，接种物的活性会在一定程度上影响发酵过程，提高接种物的活性显得尤为重要。研究表明，制作酸奶的Streptococcusthermophilus在20℃温育4 h后经冷冻，其存活率约为未经低温处理的1 000倍，存活率的提高可能与冷休克蛋白表达及其参与调控网络相关[39]。L.lactisMG1363在10℃温育4 h，其冷冻后存活力比未经低温处理的提高了近100倍，提高冷休克蛋白CspB、CspD和CspE的表达量则能增加L.lactis冷冻后的存活率[40]。这可能是因为冷冻过程中形成的冰晶、高渗、大分子物质变性以及细胞膜完整性的破坏均降低了微生物的活性，而冷冻前进行适当的低温处理能够引起细胞发生冷应激反应而产生大量冷休克蛋白，这些冷休克蛋白充当抗冻剂保护细胞免受伤害。因此，深入了解微生物冷休克和冷适应过程对低温发酵和菌种保藏将有积极意义。

3.2 低温表达系统

目前冷休克蛋白用于细菌表达系统存在一个主要的缺陷：外源蛋白容易形成包涵体[41]。相对应的解决办法主要有：①增加细胞内帮助蛋白正确折叠的分子伴侣的表达量[42]；②低温下表达外源蛋白，限制蛋白的聚集速度[43]。此外，低温除了能降低包涵体形成还能降低重组蛋白的降解[44,45]，并有利于提高目的蛋白的可溶性和稳定性[45,46]。因此，开发低温表达系统有着良好的应用前景。

Giuliodori等[39]研究阐明了E.coliCspA在冷休克反应中的高效表达机制。CspA mRNA扮演温度感应器的角色，其5′端非编码区域的构象随温度波动而改变；低温时的构象利于基因的表达，且不易被RNase降解。2004年，Qing等[47]利用E.coli冷休克蛋白基因cspA的启动子和终止子构建了低温表达载体pCold Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，并证实该系统能有效表达从原核到真核细胞的多种外源基因。2008年，Hayashi等[48]在载体上引入了GST标签和HRV 3C蛋白酶识别序列，并应用该系统表达了10个在37℃时不能可溶性表达的蛋白，其中9个蛋白可溶性表达。2013年，Freischmidt[49]开发了一种基于E.coli冷休克蛋白基因cspA5′-UTR的无细胞蛋白合成系统，该系统在低温(25℃)合成氯霉素酰基转移酶的能力高于基于T7启动子在37℃的效率。

3.3 冷休克蛋白与作物抗逆性

冷、热、旱是作物经常面临的胁迫，能够导致作物细胞基因表达模式发生改变，致使作物产量下降。研究表明，增加作物细胞中冷休克蛋白含量可以部分恢复作物细胞基因的表达模式，从而提高作物的优良性状。2008年，Castiglioni等[50]发现，转入大肠杆菌cspA基因或枯草芽孢杆菌cspB基因的拟南芥对多种逆境(如冷、热、旱)的抗性显著提高，转有相应基因的玉米产量在干旱环境下也得以提高。

3.4 冷休克反应与食品灭菌

目前食品行业主要采用高温灭菌的方法来保藏食品，近几年一种称为高水压的保藏方法也得以应用，这种方法相对于高温杀菌来说，不会严重破坏食物的营养成分，因而有很好的应用前景[51,52]。但研究发现，经高水压处理的L.monocytogenes，其体内冷休克蛋白量会显著增加，暗示该蛋白也参与了宿主对高水压环境的适应过程[53]。经冷激再高水压处理的细胞存活率较仅高水压处理的要高，表明微生物对低温和高水压的应答存在交互机制。低温和高水压处理具有协同效应，低温处理会降低高静水压的灭菌效果，因此在食品灭菌时应避免两种方法的联合使用。

4 展望

冷休克反应是普遍存在于生物体内的一种生存机制，而冷休克蛋白是冷休克反应的关键调控因子之一。冷休克蛋白参与的生理功能早已突破了冷休克反应，其可能参与了宿主对多种逆境的应答；另一方面来讲，冷休克蛋白的生理功能远不止于目前已经揭示的方面，仍需大量的研究来进一步阐明。对于含有冷休克蛋白基因的生物体来说，某一个冷休克蛋白的缺失可由另一个冷休克蛋白来弥补，或许表明了细胞内冷休克蛋白功能及表达调节存在内部网络。

低温冷激过程中冷休克蛋白急剧合成机制也为构建新型的高效表达系统提供了参考，基于冷休克蛋白基因启动子的表达载体已被日本Takara公司开发和推广。另一方面，生物尤其是微生物冷休克和冷适应机制及冷休克蛋白生理功能的揭示将会在发酵条件优化、食品储藏、菌种储藏、有害微生物抑制和作物性状改良等方面发挥积极的作用。

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Physiological Function and Potential Applications of Cold Shock Proteins in Microbes

ZHANG Xue1,2§, ZHANG Hua-fang3§, LIU Qing2,4, ZHANG Yu-wei2, LIU Bo2*

1.CollegeofLifeScienceandTechnology,HarbinNormalUniversity,Harbin150025,China;

2.BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China;

3.BeijingUrbanDrainageMonitoringCenterCo.,Ltd.,Beijing100061,China;

4.CollegeofFoodScienceandBiotechnology,ZhejiangGongshangUniversity,Hangzhou310018,China

Cold shock response, a phenomenon that results from a sudden decrease in conditional temperature, widely lies in microbes; cold-shock proteins (CSPs), some small homologous proteins were found to play important roles in cold shock response. It is revealed that CSPs regulate the expression of some genes invovled in cold shock response, and also regulate a wide range of genes expression, such as normal growth and differentiation of hosts, invasiveness and pathogenicity of pathogen, and stress response of hosts including high pressure and antibiotic stress. The paper summarized the source of CSPs, physiological characters regulation that CSPs involved, and the application of CSPs based on cold shock response, which was expected to provide reference for fermentation process conditions, food storage, inhibition of pathogens, crop genetic improvement, and so on.

cold shock response; cold shock protein; physiological function; adverse condition

2015-02-05; 接受日期：2015-03-19

国家自然科学基金(31200072)资助。

§张雪与张华方为本文共同第一作者。张雪，硕士研究生，研究方向为分子遗传学。E-mail：zx89519@163.com;张华方，高级工程师，主要从事微生物生化研究。E-mail：13811364231@139.com。*通信作者：刘波，副研究员，博士，主要从事微生物基因工程研究。E-mail:Liubo01@caas.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.04.05