基于液相色谱-质谱联用的肝微粒体中药物代谢酶定量方法研究进展

王欢欢， 吕雅瑶， 彭 博， 钱小红， 张养军*

（1. 广西医科大学药学院，广西 南宁530021；2. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京蛋白质组研究中心，蛋白质组学国家重点实验室，北京102206）

细胞色素P450 （CYP）酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移（UGT）酶在内源或外源化合物的Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢中起着重要作用。人肝微粒体中的Ⅰ相药物代谢酶主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和CYP3A4 等；Ⅱ相药物代谢酶主要包括UGT1A1、UGT1A2、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT2B4、UGT2B7、UGT2B10、UGT2B11、UGT2B15等。已有很多文献［1，2］报道CYP 和UGT 酶的表达水平具有较大的个体差异性。这些药物代谢酶含量的不同导致药物对不同个体具有不同的药代动力学和毒理学行为，直接影响药效和药物的安全性。例如，波立维（氯吡格雷）是一种用于治疗动脉粥样硬化血栓形成的药物，该药只有经过肝脏中CYP2C19药物代谢酶的代谢才具有活性。由于不同病人中CYP2C19 药物代谢酶表达量不同，波立维对不同病人的治疗效果迥异，即对一些病人效果良好，但对其他人没有疗效。另外，不仅在化学合成药物研究领域，在中药研究领域也有许多研究者开展了药物代谢酶的相关研究［3-6］。正是由于药物代谢酶表达量对药物研发和临床应用的极端重要性，已发展了多种用于药物代谢酶含量的测定方法，主要包括：蛋白质印迹（Western blot）方法、逆转录聚合酶链式扩增反应（RT-PCR）方法、探针药物法和高效液相色谱-多反应监测质谱（HPLC-MRM MS）方法。

1979 年，Towbin 等［7］发展了Western blot 方法，并将其用于复杂生物样本中特定蛋白质的鉴定。该方法已经在生物化学研究中发挥了重要作用。例如，Western blot 方法被用于人类免疫缺陷病毒（HIV）、莱姆病（Lyme disease）、乙型肝炎（Hepatitis B）等疾病的检测。另外，Western blot 方法也被较早用于药物代谢酶含量的测定。虽然Western blot 方法具有较高的灵敏度和较大的应用范围，但用于药物代谢酶定量时存在4 个关键性的问题：（1）药物代谢酶具有高序列同源性，难以制备特异性抗体；（2）具有半定量的特点；（3）线性范围较窄；（4）分析通量低，即分析样本数量有限。这些缺点限制了该方法的广泛使用。例如，Shimada 等［8］在1994 年应用该方法对60 例样本的CYP 药物代谢酶进行定量时，由于缺乏特异性抗体，只能得到3A 和2C 家族的总量，无法分别获得3A4、3A5 和2C9、2C19 的含量信息。

RT-PCR 是一种可迅速且准确地对多种生物系统的基因表达进行定量的方法，广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA 的含量［9］。这种方法定量结果的准确性主要决定于：（1）RNA 的完整性；（2）cDNA 的合成效率；（3）内参基因［10-12］。随着分子生物学、克隆技术和基因组学的发展，一些药物代谢酶的表达水平可以通过mRNA 的水平进行测定［13-16］。RT-PCR 方法的优点是具有高选择性和高灵敏度，但由于其检测对象是mRNA，而mRNA 翻译到蛋白质的表达过程还受多种因素调控。因此，对mRNA 定量并不能准确表示mRNA 翻译到蛋白质的表达水平。

探针药物法是通过比较探针药物与经药物代谢酶代谢的产物的浓度比或探针药物的清除率来衡量酶的代谢能力，实现对体内药物代谢酶的活性进行定量测定的一种方法。通过HPLC 及LC-MS 的方法可以测定药物探针的代谢物，探针药物法已经广泛用于药物代谢酶活性的测定［17-21］。为了增加分析通量，多种探针药物在单次试验中可同时用于多种药物代谢酶的活性测定，并称之为鸡尾酒法（cocktail approach）［22］。探针药物法的优点是既考虑了基因因素又考虑了环境因素对药物代谢酶活性的影响，但其缺点是操作复杂，分析周期长，底物有交叉现象，很难找到专一性化学探针药物。

HPLC-MRM MS 方法是一种用于生物样本中蛋白质绝对定量的常用技术。在应用这种技术时，首先将样本中所有目标蛋白质水解成肽段，然后通过液相色谱对酶切肽段进行分离，再通过离子源将分离的馏分离子化后进行质谱分析。进入质谱的离子具有不同的质荷比，经过第一级质量过滤器Q1选择具有特定质荷比的母离子，被选择的母离子进入碰撞诱导池（CID）中，并在CID 中通过碰撞诱导碎裂形成碎片离子，碎片离子经过第二级质量过滤器Q3 后，被选择的子离子到达质谱检测器［23］。目前，HPLC-MRM MS 方法因其高灵敏度、高选择性和高通量的特点，加之不需要特异性的抗体，已经成为药物代谢酶定量分析的常用方法［24-27］。为此，我们重点评述该方法的研究进展。

1 化学合成法制备内标肽段结合液相色谱-质谱联用的药物代谢酶绝对定量方法

采用化学合成方法合成稳定同位素标记肽段，是基于液相色谱-质谱联用的药物代谢酶绝对定量方法中较早采用的一种制备内标肽段的方法。这种方法是在化学合成过程中，将稳定同位素标记氨基酸作为原料引入到内标肽段，然后将这些稳定同位素标记的肽段加入到待测样本酶切液中作为内标，通过这些轻标肽段与相应的重标肽段的峰面积比进行定量。例如，Fallon 等［26］采用稳定同位素稀释-多反应监测质谱（SID-MRM MS）方法对9 例人肝微粒体样本中的UGT1A1 和UGT1A6 两种药物代谢酶进行绝对定量时，首先化学合成了这两种药物代谢酶的特异性肽段，其中化学合成的肽段T78YPVPF（13C9，15N）QR85和D70GAF （13C9，15N）YTLK77用于对UGT1A1 酶进行定量；化学合成的肽段D44IVEV（13C5，15N）LSDR52、S103FLTAP（13C5，15N）QTEYR113和I77YPVP（13C5，15N）YDQEELK88用于对UGT1A3 酶进行定量，基于这种方法对UGT1A1 酶的定量结果与Western blot 方法的定量结果具有良好的相关性（相关系数r ＝0.988）；Kawakami 等［27］也采用化学合成法制备了重标肽段作为内标，用SID-MRM MS 方法对10 例人肝微粒体样本中的11 种CYP 酶进行了绝对定量，发现CYP1A2、2A6、2C19 和3A4 的表达水平具有20 多倍的个体差异性；Ohtsuki 等［28］采用相同的内标制备方法，用SID-MRM MS 对17 例样本中的20 种CYP 和UGT 酶进行绝对定量，揭示了CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4、CYP2A6、UGT1A6、UGT2B7 和UGT2B15 的表达水平大于50 fmol／μg，并且分析了药物代谢酶的表达水平与药物代谢酶的活性以及mRNA 的表达水平的相关性；Liu 等［29］采用化学合成制备内标肽段结合液相色谱-质谱联用方法和药物探针法对12 例人肝微粒体样本的7 种CYP 药物代谢酶进行了定量，实验结果表明CYP3A4 酶的表达水平与酶活性具有较高相关性（相关系数r ＝0.943，p＜0.000 1）；Gröer 等［30］采用以上方法对25 例人肝微粒体样本中的9 种CYP 酶和4 种UGT酶进行了绝对定量，揭示了药物代谢酶表达水平之间的相关性。虽然基于化学合成法制备内标肽段结合液相色谱-质谱联用方法可以对药物代谢酶含量进行准确测定，但由于通过化学合成方法制备内标肽段过程复杂、耗时耗力且需要对每条内标肽段进行准确定量，不适合用于药物代谢酶的高通量、规模化定量分析。因此，迫切需要发展一种规模化制备内标肽段的方法。

2 基于定量肽段串联体蛋白质（Qcon-CATs）技术制备内标肽段结合液相色谱-质谱联用的药物代谢酶绝对定量方法

规模化制备内标肽段对于药物代谢酶含量的高通量测定至关重要，为此，Beynon 等［31］在2005 年成功设计、表达了一种人工合成蛋白质，这种人工合成蛋白质是多个目标蛋白质酶切后的特异性肽段的串联体，即将编码QconCAT 蛋白质的基因序列插入到高表达的质粒中，然后转染到大肠杆菌体内进行表达，制备QconCAT 蛋白质。由于在QconCAT蛋白质中所有目标蛋白质的特异性肽段都以等摩尔比关系存在，因此只要QconCAT 蛋白质中一条特异性肽段被准确定量，便可知其他特异性肽段的含量。鉴于QconCAT 技术制备内标肽段的优点，Achour 等［32］首次将QconCAT 制备技术应用到药物代谢酶的定量中，通过与MRM MS 方法结合对24 例样本中的13 种CYP 酶和8 种UGT 酶同时进行含量测定，揭示了药物代谢酶表达水平之间的相关性，并分析了年龄、吸烟、酒精对药物代谢酶表达水平的影响，为药物代谢酶的规模化定量开辟了新的途径。另外，我们课题组的Li 等［33］也将Qcon-CAT 技术与18O 酶促反应标记结合制备内标肽段并应用到药物代谢酶的含量测定，这种方法缩短了制备样品的时间，可对人肝微粒体中的21 种药物代谢酶进行同时定量。尽管如此，QconCAT 技术制备内标肽段也存在一些问题，例如部分内标肽段不完全标记，以及QconCAT 制备的内标肽段以相同的物质的量加入到待测样本中，对样本中丰度差异较低的药物代谢酶准确定量产生不利的影响。

3 基于液相色谱-质谱联用的药物代谢酶的相对定量方法

稳定同位素代谢标记技术（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）是蛋白质组学中一种常用的代谢标记技术，即在含有重标氨基酸的培养液中，通过代谢途径对细胞或动物体中的蛋白质进行稳定同位素标记的技术［34］。由于该方法具有高准确度，MacLeod 等［35］在传统SILAC 标记技术的基础上，通过同步配体介导的多个上游核受体的激活诱导药物代谢酶的表达，使用目标高分辨-选择性监测质谱（tHR-SIM MS）方法对鼠肝中68 种Ⅰ相代谢酶和30 种Ⅱ相代谢酶进行了相对定量。特别是在这种方法中，通过同步配体介导方法诱导药物代谢酶高表达，实现了对Cyps 1a、2a、2b、2c 和3a 等表达水平较低的药物代谢酶准确定量，这种方法为接近检出限或定量限的低表达药物代谢酶的准确定量，提供了一种新的研究思路。

4 HPLC-MRM MS 方法中降低基体干扰影响的方法

HPLC-MRM MS 方法应用于小分子的定量分析中，被分析物与基体是容易分离的［36，37］。但当这些方法用于复杂生物大分子样本中药物代谢酶（蛋白质）的定量时，首先需要对生物样本中所有蛋白质进行酶切，然后通过对不同药物代谢酶特异性的肽段进行定量，进而实现对该药物代谢酶的定量。因此，这些方法面临的一个共同挑战是，由于不同肽段构成的基体与被分析物肽段的化学性质相近，使得分析物难以分离，这些基体将与目标肽段共同通过ESI 离子源进入质谱，影响被分析物的检出限、定量限、线性范围以及定量准确度［38］。另外，一些药物代谢酶，如CYP2C19、UGT1A3，以及UGT2B11等含量较低的药物代谢酶在质谱中的信号较低，且受到基质干扰的影响而无法检测。因此，在HPLCMRM MS 方法建立和性能评价时应充分考虑基体干扰问题。常用的方法是采用空白基体消除其对分析结果的影响，但在一种样本中定量多种分析物时，难以获得空白基体。虽然有文献［39-42］报道采用外源基体作为空白基体降低基体干扰的影响，但由于与实际样本基体有较大差异，因此，这种方法的作用影响有限。为此，发展了一些新的降低基体干扰影响的方法。我们课题组的Zhao 等［43］将样本中存在的高浓度蛋白质的混合物作为空白基体，尽管与真实样本基体较接近，但仍有一定差距。Wang 等［44］采用金属元素多重标记合成肽段作为内标，采用实际样本作为基体，可解决基体干扰问题。但是由于该方法标记过程复杂，不利于实际应用。Kuzyk等［45］将样本溶液进行一系列的稀释，配制成不同浓度的样本，然后加入等量的标记肽段，经过HPLCMRM MS 分析，根据样本中被分析物与标记肽段的质谱信号强度计算出样本中待测物的浓度。虽然该方法考虑了基体干扰，但采用单点校正法计算样本中药物代谢酶的浓度，不仅计算方法会导致分析物浓度测定值与真实值之间的偏差，且经稀释的不同浓度点的样本基体浓度不同，也会使分析结果的精密度变差。综上所述，虽然用于复杂生物样本中药物代谢酶含量测定的方法研究取得了很大的进展，但更高灵敏度、更高准确度和更高通量的药物代谢酶定量新方法仍然需要进一步探索。

5 结语

综上所述，在药物代谢酶含量测定的方法中，HPLC-MRM MS 方法具有高灵敏度、高选择性和高通量的特点，加之不需要特异性的抗体，与其他经典方法相比具有更多优势；但这种方法的应用也面临一些问题，如低浓度的药物代谢酶因受基体干扰影响定量准确性和空白样本基体制备问题、规模化内标制备问题以及如何进一步提高液相色谱分离度、质谱的检测灵敏度和通量的问题。这些问题都对HPLC-MRM MS 方法在药物代谢酶定量中的应用造成困难，需要逐步解决并开发出药物代谢酶定量的新方法。

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