人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白临床研究进展

陈锦，崔丽文，陈阳

（1. 北京市食品药品监督管理局，北京100053，2.北京九强生物技术股份有限公司，北京100191）

1 NGAL基因表达及蛋白结构

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）属于lipocalin 家族蛋白，也被称作lipocalin2(LCN2) 、转铁蛋白、24P3，是人中性粒胞β颗粒中独立发现的一个糖蛋白。其基因定位于9q34、与lipocalin 家族的其它成员具有高度相似性，基因全长5869bp，包括1695bp 的5'端非转录区、178bp的3'端非转录区及由七个外显子和六个内含子构成的3696bp 的原初转录区[1,2]。NGAL 蛋白是由一条多肽链构成的分子量为25kD的糖蛋白，含178个氨基酸残基。多肽链由N 端的螺旋、C端的α螺旋和中间的八段反平行式β折叠构成的一个lipocalin家族所特有的β 折叠桶结构组成[3]。NGAL的分子质量为25000，独立存在于中性粒细胞中的过氧化物酶阴性颗粒中，有一个N-糖基化位点，其等电点约为8.4。NGAL主要以单体（25kDa）、通过二硫键相连的同源二聚体（45kDa）以及与明胶酶（gelatinase）通过分子间二硫键形成共价的异源多聚体（135kDa或220kDa）三种分子形式存在。作为疏水性小分子转运的载体，能与细胞表面的受体相互作用，表现多样化的生物功能，参与胚胎发育、细胞分化、炎症及免疫反应、细胞凋亡、信号转导、糖类脂质代谢、肿瘤的形成及侵袭转移等多种生理及病理过程[4]。目前认为NGAL蛋白能运输介导炎症反应的一些亲脂性分子，如血小板活化因子（PAF）、白三烯B4（ LTB4）和脂多糖（LPS）等；调节MMP-9活性，并可能参与清除炎症介质，调节免疫反应，抑制细胞凋亡以及肿瘤的发生发展、浸润转移等过程。NGAL还通过与含铁的铁载体结合，形成NGAL-铁载体-铁复合物，参与肾脏的发生、发展及修复过程。NGAL是一种具有铁离子螯合转运功能的脂质蛋白，其体内表达水平可以反映肾小球滤过屏障、近端肾小管的重吸收功能和远侧肾单位的损伤情况。在正常的生理状态下，除了中性粒细胞以外，NGAL在人类很多组织如支气管、胃、小肠、胰腺、肾脏等的上皮细胞中有低水平表达。而在病理状态下，这些组织的上皮细胞则有大量NGAL表达, 特别是在损伤的近端肾小管上皮细胞中。

2 NGAL与肾脏疾病

肾脏的发育因受输尿管芽分泌因子的控制，由间质细胞向上皮细胞转化；NGAL是诱导上皮细胞形成输尿管芽分泌因子之一[5]。在正常生理条件下，NGAL在人体内含量较低，但是可以促进肾脏祖细胞向肾小管上皮细胞分化，以保障肾脏生长发育；当肾缺血或毒素急性损伤肾小管时，在开始的两个小时内，受损的肾小管上皮细胞能高表达NGAL，从而诱导肾小管一间质中浸润的中性粒细胞发生凋亡，以保护肾组织免受攻击，另一方面诱导肾小管上皮细胞修复再生、促进肾脏功能恢复，反映肾脏功能的变化。通过转录筛选早期缺血性肾脏肾基因表达状况，发现NGAL基因表达超过正常对照组10倍，同时在急性肾损伤的人类甚至皮质小管、血液和尿液均发现有大量的NGAL堆积[6]。

临床检测急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是由于各种原因引起的肾功能在短时间内的突然下降而出现的临床综合征，其主要发病原因是肾灌注量减少导致血流动力学介导的肾小球率过滤降低引起。肾脏局部缺血和再灌注损伤，不存在肾实质损伤，如果能及时纠正肾灌注量减少，则能逆转血流动力学损害，使肾功能恢复。否则可发生细胞明显损伤而导致急性肾小管坏死。尽管临床治疗和监护水平有了很大提高，但AKI及由此引发的并发症率居高不下，主要原因就是缺乏早期特异性的生物指标[6]。Mishra[7]等（2003）首次提出NGAL可作为急性肾脏病变的早期标志物，在肾脏发生急性损伤时，在肾脏发生缺血的极早期（≤2小时），NGAL在血、尿中的含量即明显升高；而当治疗后，血清NGAL水平明显下降。另一方面当对肾脏缺血-再灌注模型小鼠注射重组NGAL后发现氮质血症明显减轻、肾脏损伤明显改善。随后进一步发现，患者病情越严重，血清NGAL水平越高，预后效果欠佳。通过与其他相关指标进行对比分析，NGAL可作为急性肾损伤病情检测及预后判断的敏感指标。急性肾功能损伤中NGAL水平偏高，预后将发展成为急性肾功能衰竭。急性肾功能衰竭是心脏手术、肾毒性、肾移植常见的并发症，NGAL可以作为判断急性肾衰竭病情加重的一项生物指标。有文献报道，NGAL在儿童和成人心肺搭桥手术、冠心病介入治疗、在急诊科或加护病房的重症患者（心脏衰竭、多器官功能衰竭）、肾移植等情况可以作为早期检测AKI的指标[8～14]。

既然大量的证据表明NGAL可作为AKI的早期诊断指标，国内外学者开始探讨NGAL在CKD（chromic kidney disease，CKD）早期诊断和疾病进展中的作用以及与肾功能的关系，试图证明NGAL也是CKD肾脏损害的一个指标。主要的假设是慢性肾脏损害也像AKI一样影响NGAL的生理平衡，慢性损害的小管细胞产生大量的NGAL，而NGAL水平增加不是因为肾脏清除这种蛋白的能力降低所致，而是因为在活动性慢性损害的刺激下小管细胞产生NGAL增多[15]。为此，国内外学者对多种导致慢性肾损害的肾脏疾病及动物模型作了相关研究。Bolignano等[16]在研究发现，在CKD患者中，NGAL能确切反映肾脏损害的程度，是CKD进展的一个强力和独立的风险指标。在对成人型多囊肾的研究中也发现，患者的血和尿NGAL水平均显著高于正常对照组，且与血肌酐呈显著正相关，与GFR呈显著负相关，其相关性优于血肌酐与GFR的相关性，并且NGAL水平可能与囊的增长有关。孙建敏等[17]将48例2型糖尿病肾病患者根据尿白蛋白排泄率分为正常白蛋白尿组、微量蛋白尿组、临床肾病组，同时选取12例健康对照组检测，发现各组NGAL水平随尿白蛋白排泄率水平增加而增加，尿NGAL水平有望作为一种敏感指标用于临床检测。

NGAL 参与慢性肾脏疾病的机制复杂，一方面NGAL 可以促进EGFR的表达，诱导肾小管上皮细胞修复再生，参与慢性肾病恢复；另一方面NGAL通过激活炎症因子IL-1β、TNF-a、IFN-γ致肾脏细胞再生，参与致慢性肾脏疾病的发展。但是临床分析88例慢性肾脏病患者时发现，虽然血清的NGAL含量与慢性肾病发病明显相关，可作为疾病诊断指标，但NGAL含量的变化与肾脏疾病进展无明显相关性；虽然HMG-CoA还原酶抑制剂药物阿托伐他汀能够降低血清的NGAL水平，但具体机制不清。

Bolignano等研究发现在持续性蛋白尿患者引起的慢性肾功能衰竭患者中，尿NGAL水平与24h尿蛋白量、血肌酐、GFR均有很好的相关性，较高尿NGAL水平的患者在1年的随访中肾功能显著恶化，研究结果提示NGAL在持续性大量蛋白尿所致小管病变中可能其关键作用，可作为CKD患者肾功能变化的新预测指标。Ding等检测了70例不同组织学程度（按Lee分级）和肾脏损害的IgA肾病患者的NGAL，结果发现Lee2级和3级患者的尿NGAL水平显著增高，但血NGAL水平与健康对照组之间的差异无统计学差异。此外，对6个月治疗有反应的患者尿NGAL水平明显下降，无反应这仍然增高。由此说明尿NGAL水平可能是反应早期IgA肾病小管间质损伤的敏感指标。

随着NGAL在CKD中研究的不断深入，NGAL与CKD的关系愈来愈令人瞩目，不能仅仅把NGAL作为CKD的一种标志性蛋白进行研究，更需明确NGAL在CKD中的表达情况，深入探讨NGAL在各种原发或继发性肾脏疾病中的作用，从而为临床干预CKD的进展，治疗慢性肾功能衰竭开拓新的途径。

3 NGAL与胰岛素抵抗

胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病的发病基础，在血脂异常、肥胖、代谢综合征等多种糖脂代谢紊乱相关疾病也起重要作用。胰岛素抵抗能够改变细胞葡萄糖及能量的代谢、利于形成异常脂蛋白血症，从而影响2型糖尿病、代谢综合征等疾病的发展[3]。临床研究发现胰岛素抵抗患者中NGAL表达水平明显升高，但目前关于NGAL调节胰岛素抵抗的观点不一。多数研究发现NGAL 在不同情况下参与胰岛素抵抗。NGAL可以通过调控TNF-a 影响胰岛素抵抗，在炎症状态下LPS 虽然没有明显增加脂肪细胞的NGAL表达，但是内毒素和饱和脂肪酸却能增加血浆中NGAL 的含量，增强NGAL引起的胰岛素抵抗；另一方面发现虽然肥胖患者的内脏脂肪细胞的NGAL 表达明显升高，并且与多种炎症因子明显相关，但是血浆中NGAL 的含量升高却不明显，然而当随着体重的下降时循环中NGAL 含量却明显下降，提示血浆中的NGAL 可能同时来源于脂肪细胞以外的相关组织细胞，并且可能受相关炎症因子影响和调控。

任国华等[18]对30例妊娠期糖尿病（GDM）患者进行血清NGAL水平检测，孕妇血清NGAL、空腹血糖、胰岛素水平、Homa Model –IR均明显高于正常对照组，且GDM组孕妇血清NGAL水平与HOMA-IR及胰岛素水平成正相关，而与孕前体质量指数（BMI）无明显相关。Auguet等发现NGAL表达与体重指数明显相关，重度肥胖者血浆中NGAL 明显升高、内脏脂肪细胞的NGAL明显高表达；Corripio等研究发现肥胖儿童的NGAL水平随着体重下降却无明显变化，提示在调节糖脂代谢时NGAL有着不同于的脂肪酸结合蛋白的作用机制。另外临床研究发现NGAL虽然与酒精摄入和血浆HDL相关，参与糖脂代谢，但NGAL与胰岛素敏感性却无明显相关性。总之，目前研究倾向于NGAL参与了糖脂代谢及能量调节，但是NGAL在糖脂代谢的功能机制及其与胰岛素抵抗的确切关系和机理的复杂性有待进一步研究。

4 NGAL与肿瘤

恶性肿瘤细胞分泌蛋白分解酶，降解细胞外基质，这是肿瘤侵袭和转移的关键。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是其中最重要的一类蛋白水解酶。不仅可降解基底膜和基质，突破细胞外基质屏障，促进肿瘤侵袭和转移，还能通过毛细血管内生、新血管生成等促进肿瘤生长和扩散，与肿瘤的侵袭及转移有着异常密切的联系。NGAL是活化中性粒细胞中释放的多功能蛋白，可结合MMP-9 形成复合物，保护MMP-9不被降解，维持MMP-9 酶活性；同时，还可结合转运小分子铁化合物到细胞膜，从而激活或抑制铁应答基因。体外研究证明，NGAL 能增强细胞铁吸收能力，促进上皮细胞和间质细胞间的转化。NGAL 通过自分泌方式，负调控红细胞生成。过量NGAL可抑制红细胞前体细胞分化，并诱导凋亡。说明NGAL 与肿瘤发生、发展以及侵袭和转移都密切相关。NGAL能抑制H2O2导致的细胞凋亡，推测其可能具有缓解细胞在氧化应激条件下所受的损伤。人NGAL同小鼠24p3蛋白具有高度同源性，表明该基因就是一种潜在的致癌基因。

NGAL在肿瘤组织中呈现过表达现象，有研究表明，在食管癌、卵巢癌、乳腺癌、肺腺癌、结肠腺癌、胰腺癌中呈高表达状态；在肾细胞癌和前列腺癌中呈低表达状态；淋巴癌和胸腺肿瘤中不表达[19]。可见NGAL 在肿瘤中的表达具有不均一性，随组织类型不同而表达各异。NGAL在肿瘤组织中表达调控机制，随着研究深入，愈加发现其复杂性和组织特异性。NGAL基因在各种癌细胞中表达调控特点各不相同，提示NGAL基因的表达调节存在细胞特异性。

5 NGAL与炎症

NGAL是细菌化学趋化物N-甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸的受体之一，可诱导白细胞内颗粒释放，趋化炎症细胞聚集，消灭病原微生物，在炎症损伤中表现为抗炎抑菌作用。目前，越来越多的研究表明，在炎症相关的疾病中，均有NGAL 呈高表达状态，如泌尿系统感染、胃肠道炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘等。NGAL在细菌性感染疾病中表现高表达，其敏感性和特异性均>95%。另一方面，NGAL可结合含铁复合物，阻止微生物对铁的摄取，从而抑制细菌生长[5]。贾芙蓉等研究发现，NGAL可用于急性细菌与病毒感染鉴别的敏感性、特异性较血常规、C反应蛋白等更高，鉴别能力更好[20]。

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是在脂质代谢紊乱的基础上形成的血管内皮损伤导致的慢性持续性炎症反应性血管疾病，NGAL既参与了胆固醇的代谢又同时与炎症相关，提示NGAL可能通过调节慢性炎症反应和影响动脉粥样斑块的不稳定性，参与了动脉粥样硬化的病理过程。慢性炎症反应贯穿于AS 的启动、形成和发展以及粥样不稳定斑块的形成，炎症反应作为动脉粥样硬化过程中许多病理生理改变的共同基础，日益得到重视。临床研究发现NGAL 与颈动脉粥样硬化明显相关，并且其表达受患者的年龄、血压、表皮生长因子受体、肌酐含量及血管紧张素转换酶抑制剂等因素影响。NGAL 能够调节血管壁的慢性炎症反应和影响粥样斑块的不稳定性，在动脉粥样硬化不稳定斑块患者中，血清中NGAL含量明显升高，并且NGAL 可以调节心脏移植的缺血-再灌注心肌细胞炎症损伤。邹玉海等[21]在对72例行经皮冠状动脉诊疗术患者检测术前NGAL浓度，发现血清中NGAL浓度在冠脉狭窄程度达75%以上时中表达水平显著升高，NGAL可作为冠状动脉狭窄程度的重要预测因素，可能是心肌缺氧的一个良好的生物标志物。

6 相关的临床检测方法

目前检测NGAL的方法有酶联免疫吸附法（ELISA），该法将已知浓度的校准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测，先将NGAL和生物素标记的抗体同时温育，洗涤后加入亲和素标记过的HRP，在经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物，和酶结合物同时作用，产生颜色，颜色深浅和样品中NGAL的浓度呈正比例关系。美国雅培公司研发的尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）测定试剂盒运用化学发光微粒子免疫检测法（CMIA）定量测定人尿液中的NGAL。重庆业为基生物科技有限公司开发了尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）检测试剂（胶体金法）；北京九强生物技术股份有限公司、上海科华生物工程股份有限公司采用胶乳增强免疫比浊法的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒已经获批上市，可使用血浆或尿液样本检测；南京诺尔曼生物技术有限公司的免疫增强比浊法NGAL测定试剂盒、武汉生之源生物科技有限公司胶乳增强免疫透射比浊法的NGAL检测试剂盒也已获批，适用人体血清、尿液样本NGAL含量的检测。该类试剂盒可应用与全自动生化分析仪上，仅需数滴血浆（血清）或者尿液，就能快速得到NGAL的测定结果，可广泛应用于NGAL的批量及急诊的检测诊断。张洪瑞等[22]对市售的上海科华生物工程股份有限公司的胶乳增强免疫比浊法的NGAL试剂盒按照美国临床和实验室标准协会的评价方案和相关文件进行了验证性研究，结果显示，评价的胶乳增强免疫比浊法NGAL试剂盒测定血浆和尿液NGAL的不精密度符合要求，线性范围宽，与国外Bioporto NGAL试剂盒检测结果基本一致，在临床上可接受。

7 结语

NGAL是一种新型蛋白，与肾病、胰岛素抵抗、肿瘤、炎症等都有一定的相关性，但很多确切的机制尚不明确，继续深化了解NGAL在各种疾病中的作用，将为临床的诊断、治疗、预后提供更多、更好的手段。尽管已有多种NGAL检测试剂盒上市，但对疾病预测的灵敏度、特异度等指标不尽相同，尚缺乏对不同试剂间的系统的方法学和诊断效能的评价。通过建立新的实验方法，并对NGAL试剂盒进行测定,根据NCCLS相关文件，对方法进行精密度，线性，方法学比较的相关性等评价。通过验证不同厂家的NGAL试剂盒，比较不同厂家NGAL试剂的相关性将对NGAL的临床应用起到重要作用。而商业开发的性能优良的NGAL试剂将有利于大规模临床验证和多中心的队列研究。

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