大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马CA1区TREK-1、GFAP表达变化

大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马CA1区TREK-1、GFAP表达变化

袁建清，廖春英，黄樱

(赣南医学院第一附属医院，江西赣州 341000)

摘要：目的观察新型双孔钾离子通道亚单元TREK-1及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马CA1区的表达变化。方法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型，应用免疫荧光组化和激光扫描共聚焦观察正常大鼠及MCAO 再灌注后3、7、30天海马CA1区TREK-1和GFAP表达情况，同时应用Western blotting法检测大鼠MCAO 再灌注后3、7、30天海马CA1区TREK-1、GFAP蛋白表达。结果成年大鼠海马CA1区可见TREK-1和GFAP双标阳性的细胞，而未见有TREK-1和NEUN双标阳性的细胞；MCAO 再灌注后3、7、30天海马CA1区TREK-1和GFAP表达逐步上调，与正常大鼠比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马CA1区TREK-1、GFAP表达均升高。

关键词：脑缺血；海马；TREK-1；钾离子通道；胶质纤维酸性蛋白；星形胶质细胞

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.014

中图分类号：R743.31 文献标志码：A

收稿日期：(2015-08-11)

通信作者：黄樱

星形胶质细胞在脑缺血病理过程中起重要作用，在缺血后不同时程，增殖活化不同，有保护或加重神经元损伤的功能[1，2]。研究[3～5]表明，TREK-1通道可能参与了脑缺血后星形胶质细胞神经保护作用，双孔钾通道TREK-1表达于成熟星形胶质细胞，介导线性I-V关系的背景K离子电流和低的膜电位，有助于调控水及离子动态平衡、清除兴奋性毒性物质、氧自由基，发挥神经保护作用。大鼠脑缺血后海马TREK-1表达情况及与星形胶质细胞活化、增殖的关系国内外尚少见报道。2013年5月，我们观察了大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO)脑缺血再灌注后大鼠海马CA1区TREK-1及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化，探讨TREK-1与星形胶质细胞活化的关系，为探索脑缺血治疗的新的作用靶点提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料成年(3月龄)健康雄性Wistar大鼠48只，体质量250～300 g，由赣南医学院动物实验中心提供。兔抗TREK-1购于以色列Alomone Labs公司，小鼠抗NEUN购于美国Chemicon公司，小鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)购于美国Neomarkers公司，异硫氰酸荧光素( FITC) 标记的羊抗小鼠IgG和花青素(Cy3) 标记的驴抗兔IgG购于美国Jackson ImmunoResearch公司。普通小牛血清、普通羊血清和普通驴血清购于美国Jackson ImmunoResearch公司，Cocktail (蛋白酶抑制合剂)购于美国Sigma公司，ECL显色试剂盒购于美国Pierce公司。恒冷切片机(德国Leica公司CM1900型)，激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus公司FV500型)，台式低温离心机(德国Eppendorf公司5804R型)，电泳仪(美国Bio-Rid公司)，凝胶成像分析系统(美国Gene Genius公司)。

1.2MCAO制备及分组应用线栓法[6,7]建立MCAO模型。将实验大鼠随机分为4组，分别为假手术(sham)组、MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 30 d组，每组12只，6只用于免疫组化检测，6只用于Western blotting检测。术前12 h禁食，自由进水。用6%水合氯醛麻醉(300 mg/kg体质量)，术中维持动物直肠温度(36.6±0.5)℃。分离并结扎右侧颈总动脉、颈外动脉，注意避免刺激迷走神经。于颈总动脉近颈内动脉、颈外动脉分叉处剪一小口，插入一前端5 mm涂以硅胶的4-0丝线进入颈内动脉，深度为距离颈总动脉分叉处1.8～2.0 cm，1 h后拔出丝线进行再灌注。按Longa等[7]神经功能评分1～3分者入选MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 30 d组。假手术组除不插线栓外余步骤同上, 并于24 h后取材。术后在约20 ℃的环境下单笼饲养，自由进水、进食。

1.3缺血后大鼠海马CA1区TREK-1、GFAP表达检测①定性检测：采用荧光免疫组化法。造模后的各组大鼠快速断头取脑，将脑组织置于-80 ℃冷冻保存。-20 ℃恒冷切片机自视交叉处开始，行10 μm厚连续冠状切片。冰冻切片置4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中(4 ℃)固定15 min，PBS振荡清洗3次，每次5 min，滴加3%普通驴血清(NDS/PBS)封闭液封闭2 h，弃血清，将相连切片分成两组，分别滴加兔抗TREK-1(1∶200)、小鼠抗GFAP(1∶200)或兔抗TREK-1(1∶200)、小鼠抗NEUN(1∶200)进行双标，4 ℃孵育过夜；PBS振荡清洗3次，每次5 min，滴加羊抗小鼠FITC(1∶200)和驴抗兔Cy3(1∶200),室温避光孵育1 h，流水冲洗40 min后，50%甘油封片。荧光显微镜下观察，激发/发射波长为550/565 nm的CY3呈红色荧光，表示TREK-1蛋白；激发/发射波长为488/525 nm的FITC呈绿色荧光，表示神经元或星形胶质细胞染色；双标阳性的星形胶质细胞为黄色。②定量检测：采用Western blotting法。造模后的各组大鼠在脑缺血后相应时点快速断头取脑，在冰上迅速剥离出右侧海马，然后进行样品的制备、蛋白溶度的测定、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及转移电泳至PVDF膜，最后进行免疫酶染色，其过程如下：0.1%TBST洗PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗即兔抗TREK-1(1∶200)，4 ℃缓慢动摇过夜，0.1%TBST洗PVDF膜, 加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗IgG(1∶1 000)，室温缓慢摇动1 h, ECL显色液显色，高敏胶片摄片洗片。另增加内参照蛋白β-actin检测(兔抗β-actin，1∶200)，阴性对照组不加一抗，其余相同。测定Western blotting蛋白条带的光密度(OD)值。

2结果

2.1大鼠海马CA1区TREK-1、GFAP的定性表达TERK-1呈红色荧光，双标阳性的细胞呈黄色。TREK-1选择性地表达于星型胶质细胞，神经元上未见有表达。在大鼠海马CA1区可见形态正常呈树根状或放射状的绿色荧光的星形胶质细胞(GFAP阳性)，亦可见到形态正常的呈绿色荧光的神经元(NEUN阳性)。GFAP是星形胶质细胞特异性标志物，NEUN是神经元特异性标志物，二者均呈绿色荧光。应用免疫荧光和激光扫描共聚焦观察，MCAO再灌注后，星形胶质细胞增生肥大呈活化状态，缺血再灌注后3、7、30 d 可见TREK-1和GFAP表达逐渐增强。

2.2MCAO再灌注后海马CA1区TREK-1、GFAP表达变化Sham、MCAO 3 d、MCAO 7 d和MCAO 30 d组海马区TREK-1蛋白表达水平分别是0.46±0.09、0.90±0.10、1.12±0.17和1.70±0.24，GFAP蛋白表达水平分别是0.40±0.07，0.74±0.08，0.94±0.14和1.40±0.20,Sham组与其他三组比较，P均<0.05；MCAO 30 d组与MCAO 3 d、MCAO 7 d组比较，P<0.05。

3讨论

双孔钾离子通道(K2P，KCNK)是近年来发现的一类新型钾离子通道，具有6个跨膜结构(6TMS)和2个孔道结构(2P)，广泛分布于各种组织，在可兴奋细胞和非可兴奋细胞中均有发现[4]。通过鼠类中枢神经系统K2p基因原位杂交研究显示，在所有的双孔钾离子通道亚型中，有7种表达于成年鼠类的中枢神经系统，包括TASK-1、TASK-3、TWIK-1、 THIK-1、TRAAK、TREK-1和TREK-2[8,9]。K2P对经典的钾离子通道阻滞剂如四已基胺(TEA)、4-氨基吡啶(4-AP)等不敏感[4]，但能被体内外众多生理病理因子及化学、机械刺激所调控[4,5,8]，包括多聚不饱和脂肪酸、神经递质、溶血磷脂酸、第二信使、挥发性麻醉剂、临床上的某些神经保护剂，还有细胞内外的pH值、渗透压、氧分压的改变、温度变化及机械牵张等。K2P表达具有线性I-V关系的背景K电流，其电流是瞬时性和非失活性的，不具有时间和电压依赖性[4,5]，参与调节背景钾电流，在细胞膜电位的复极化和膜静息电位的形成中起重要作用，并能稳定膜电位，调节细胞的兴奋性[4]。

TREK-1是双孔钾离子通道的一种亚型，通过TREK-1基因敲除的小鼠研究表明，TREK-1在脑缺血中起着重要的脑保护作用，TREK-1-/-的小鼠对脑缺血损伤的敏感性明显增加[10]。脑缺血过程中，花生四烯酸释放，细胞内pH值下降，神经元发生肿胀。这些病理改变可在突触前后开放 TREK-1。通道开放导致的超极化会抑制突触前膜上电压门控的钙通道激活从而减少谷氨酸的释放。在突触后膜，超极化能加强镁离子在负的膜电位下对NMDA受体的阻断效应，这样就减少了钙离子的内流，从而降低谷氨酸的转运和兴奋毒性。突触后水平TREK-1的开放还会对抗由离子型谷氨酸受体的激活引发的去极化。相反地，刺激代谢型谷氨酸受体会导致TREK-1的关闭，减少其神经保护作用[10,11]。

近年来对脑缺血研究一直集中于神经元，但迄今尚无有效根治措施。研究[12,13]表明，星形胶质细胞在脑缺血病理过程中起重要作用。脑缺血后星形胶质细胞肥大增生，呈活化状态，即GFAP表达增强，不同时程可发挥保护或损害神经元的作用。星形胶质细胞的神经保护作用依赖于其表达特征性的具有线性I-V关系的被动电传导，且具有低的膜电位(-75 mV)及低的膜电阻[14]。有研究[15]通过细胞培养离体实验表明TREK-1功能性表达于海马区成熟的星形胶质细胞，脑缺血后TREK-1与星形胶质细胞活化有一定关系，并认为脑缺血时所产生的损伤因子可能通过作用于星型胶质细胞K2P来影响胶质细胞的活化增植及缓冲功能，从而影响神经元的命运。

本实验通过在体研究发现，鼠海马CA1区TREK-1选择性表达于星形胶质细胞，MCAO再灌注后，海马TREK-1表达逐步上调且与星形胶质细胞的活化有一定关系。

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