缺血预处理对下颌下腺缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

孙斌，高峻田，石亮，宋代辉，魏奉才(山东大学口腔医学院，山东省口腔生物医学重点实验室，济南500; 山东大学齐鲁医院，山东大学口腔医学研究所)

缺血预处理对下颌下腺缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

孙斌1，高峻田2，石亮2，宋代辉1，魏奉才2
(1山东大学口腔医学院，山东省口腔生物医学重点实验室，济南250012; 2山东大学齐鲁医院，山东大学口腔医学研究所)

摘要:目的观察缺血预处理(IPC)对下颌下腺缺血再灌注(I/R)损伤大鼠的保护作用，并探讨其机制。方法将48只大鼠随机分为模型组和观察组各24只，均制作右侧下颌下腺I/R损伤模型。观察组在制模前行IPC，夹闭颌外动脉下颌下腺供血支3 min，再灌注3 min，重复3次。以左侧下颌下腺作为对照组。再灌注1、12、24、72 h，取6只大鼠检测各组腺体分泌量、组织学变化、紧密连接结构及M受体表达情况。结果对照组腺体分泌量、组织形态、紧密连接结构及M受体表达情况均正常。I/R后1、12 h，模型组腺体分泌量明显降低，观察组稍有降低，24 h时两组分泌量开始增加，至72 h逐渐恢复正常。模型组腺实质细胞萎缩，间质水肿及炎症浸润，电镜下超微结构观察显示紧密连接结构破坏，宽度降低，均在再灌注12 h后最为严重，观察组部分腺体组织出现上述情况，且反应较轻。模型组I/R后，M受体水平1、12 h下降明显，观察组稍有下降，72 h时逐渐恢复。结论IPC对下颌下腺I/R损伤大鼠具有保护作用，其机制与上调下颌下腺M受体的表达、保护下颌下腺紧密连接结构有关。

关键词:缺血预处理;缺血再灌注;下颌下腺;下颌下腺移植;角膜干燥症

重症角膜干燥症(干眼病)多采取血管化自体下颌下腺移植治疗。研究显示，缺血再灌注(I/R)损伤会导致下颌下腺分泌降低，而缺血预处理(IPC)对移植下颌下腺的分泌功能有一定保护作用［1］。为了探讨IPC对下颌下腺I/R损伤大鼠的保护作用及其机制，2014年3～9月，我们进行了如下研究。

1　材料与方法

1.1材料健康雄性Wistar大鼠48只，体质量约200 g，由山东大学动物中心提供。4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司) ;冰冻切片机;激光共聚焦显微镜(Leica，TCS，SP2) ;透射电子显微镜H-7000(Hitachi，Tokyo，日本)。

1.2模型制作及干预方法将大鼠随机分为模型组和观察组，各24只，均制作右侧下颌下腺I/R损伤模型，以左侧下颌下腺作为对照组。腹腔注射10%水合氯醛麻醉，颈部正中切口分离肌肉、筋膜，寻找下颌下腺血管、神经及下颌下腺导管束，游离并保护舌神经支配下颌下腺的分支，保留副交感神经的支配作用。夹闭颌外动脉下颌下腺供血支90 min后行再灌注恢复血流。观察组于制模前行IPC，夹闭颌外动脉下颌下腺供血支3 min，再灌注3 min，重复3次。

1.3相关指标观察

1.3.1下颌下腺分泌量于再灌注1、12、24、72 h各取6只大鼠，于麻醉状态下分离损伤侧及对照侧下颌下腺导管至口底并切断，于断端处插入直径约0.5 mm的聚乙烯塑料小管，行Schirmer试验测定下颌下腺分泌量，以5 min内滤纸条(35 mm×5 mm)湿润长度表示，测量3次取均值。

1.3.2下颌下腺组织形态①组织学形态:测定下颌下腺分泌量后，游离大鼠双侧下颌下腺并摘除，各取部分组织用10%中性甲醛固定，水洗、脱水、透明、包埋后切成5 μm厚切片，HE染色后封固，于光学显微镜下观察腺体组织学形态。②紧密连接结构:另取腺体组织块约1 mm3，2.5%戊二醛固定，切片后用醋酸双氧铀及枸椽酸铅染色，于透射电子显微镜下随机选取10个视野，观察下颌下腺腺体细胞间紧密连接超微结构，使用图形测量软件测量其宽度，取均值。

1.3.3下颌下腺组织M1、M3受体采用免疫荧光法检测。抗M1、M3受体(1∶100)免疫标记组织切片，4℃孵育过夜。次日取出后室温下复温30 min，滴加荧光FITC标记二抗(1∶50) 37℃孵育30 min，滴加DAPI(着染细胞核)孵育3 min，0.01 mmol/L PBS漂洗，封片，使用激光共聚焦显微镜观察。M1、M3受体定位于腺泡细胞细胞膜与细胞质中，免疫荧光标记显示绿色荧光，以绿色荧光信号强度来衡量其表达强弱。

1.4统计学方法采用SAS9.1.3统计软件，计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三组下颌下腺分泌量对照组下颌下腺分泌量正常，各时间点均无明显变化。I/R后1、12 h，模型组、观察组腺体分泌量降低，模型组降低更为明显著(P均＜0.05) ; I/R后24 h两组下颌下腺分泌量开始增加; I/R后72 h两组恢复正常。见表1。

表1　三组I/R各时间段下颌下腺分泌量比较(mm，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05。

组别　n 下颌下腺分泌量1 h　12 h　24 h　72 h观察组　6 3.67±0.25*Δ3.00±0.18*Δ4.00±0.43　3.58±0.30模型组　6 1.75±0.21*1.92±0.24*　4.08±0.30　3.67±0.33对照组6 4.04±0.25　3.83±0.23　3.83±0.21　4.04±0.24

2.2三组下颌下腺组织形态学

2.2.1组织学形态对照组为正常腺泡及导管形态。I/R后1 h模型组腺体实质细胞出现轻度萎缩，间质水肿和充血，可见少量单核细胞;观察组与对照组形态相近。I/R后12 h模型组腺泡细胞及导管细胞严重萎缩，组织水肿明显，导管系统组织破坏，腺小叶及腺导管中炎症反应较轻，以早期中性粒细胞为主;观察组少部分腺体组织出现模型组情况，但反应较轻。I/R后24 h两组均可见炎症反应，以少量单核—巨噬细胞为主，组织水肿减轻。I/R后72 h两组腺体逐渐恢复，腺泡及导管形态恢复正常。

2.2.2紧密连接结构对照组相邻腺泡上皮细胞间靠近腺泡腔处存在完整、清晰的细胞间紧密连接。I/R后1 h，模型组相邻腺泡上皮细胞间的紧密连接变模糊，结构开始崩塌，电子密度降低明显，与对照组相比，细胞间紧密连接的宽度明显减少(P＜0.05)，I/R后12 h更为明显(P＜0.01)。观察组I/R后1、12 h紧密连接宽度减少明显，但是在电镜下结构仍较清晰，并且在I/R 后12、24 h与模型组相比P＜0.05。I/R后24 h观察组与模型组细胞间紧密连接电子强度逐渐增加，至72 h两组相邻腺泡上皮细胞间紧密连接的超微结构逐渐恢复成正常的索状结构。三组细胞紧密连接结构宽度比较见表2。

表2　三组I/R各时间段紧密连接结构宽度比较(nm，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05。

组别　n 紧密连接结构宽度1 h　12 h　24 h　72 h观察组　6　10.74±0.20*10.34±0.30* #12.80±0.22* #16.05±0.27模型组　6　9.64±0.16*　4.02±0.17*　8.66±0.26*　15.19±0.14*对照组　6　17.04±0.63　18.08±0.46　17.46±0.38　16.94±0.51

2.3三组M1、M3受体表达I/R后12 h，模型组M1、M3受体荧光信号信号较对照组明显下降，观察组荧光信号强度明显高于模型组; I/R后24 h模型组与观察组荧光信号开始明显升高，72 h时模型组与观察组的M1、M3受体荧光信号强度逐渐接近对照组。

3　讨论

自体下颌下腺移植治疗重症干眼病需经历I/R的过程，I/R后血管内皮细胞损伤，组织渗出增多，白细胞和巨噬细胞激活，导致多种趋化因子和细胞黏附分子大量生成、释放，进一步介导下颌下腺局部组织细胞的炎症损伤。正常颌下腺的分泌主要由交感和副交感神经调节，其中主要由副交感神经末梢释放的乙酰胆碱(Ach)通过激活M受体来调控水和电解质分泌。M1、M3受体主要参与腺体水和电解质的分泌，维持并保护腺体的分泌功能［2，3］。研究表明，M受体及其信号通路在I/R引起的脑血管、心脏等疾病表达中均下调，再灌注损伤的组织受到大量活性氧等自由基刺激而造成损害，IPC能有效缓解相应组织损伤［4］。我们的前期研究证实，家兔下颌下腺移植早期M1与M3受体mRNA与蛋白表达及其信号转导通路均下调。对M受体下游通路进一步研究显示，自由基清除剂金属蛋白酶抑制剂(MPI)可阻断Ach的保护作用，证实适量的活性氧是Ach作用于M受体预处理保护机制的第二信使［5］。唾液是通过旁细胞途径形成的，研究显示旁细胞途径是体外灌注的家兔和大鼠下颌下腺水转运的主要方式［6］。旁细胞途径由相邻细胞之间的连接复合体和细胞间隙组成，紧密连接位于连接复合体的最顶端，是物质通过旁细胞通路转运的限制因素，具有屏障和栅栏的功能［7］。紧密连接的动态调节是组织器官许多病理生理变化的基础，如I/R损伤。大量研究发现，在大脑、肺、肠道等器官发生I/R，其相应细胞间的紧密连接都会发生不同程度的损伤［8，9］。本研究观察了I/R与IPC后大鼠下颌下腺组织在电镜下紧密连接的超微结构及紧密连接的宽度，结果显示，I/R 后1、12 h，I/R大鼠下颌下腺腺泡细胞间的紧密连接结构崩塌，紧密连接宽度降低，而IPC能相对改善紧密连接结构、宽度。提示紧密连接蛋白结构的改变参与了腺体的前期分泌降低，IPC可能通过调控M受体维持紧密连接蛋白固有结构从而起到保护作用，从而改善下颌下腺的分泌功能。

本研究发现，模型组大鼠下颌下腺在保留神经支配的情况下行I/R 1～12 h，腺体的分泌功能较正常侧明显降低，显微镜下观察到腺泡细胞与导管细胞萎缩，间质组织水肿及炎症反应明显等组织学改变，这与I/R后腺体的分泌功能变化相符，证实I/R后的损伤—应激反应是移植下颌下腺早期分泌功能损伤低下的重要原因;而观察组腺体组织损伤明显减轻，I/R 12 h后下颌下腺的分泌量明显提高。证明IPC能减轻I/R引起的早期下颌下腺损伤，改善早期移植下颌下腺的分泌功能。

综上所述，I/R可能导致大鼠下颌下腺M受体表达下降，引起下颌下腺组织损伤，从而影响下颌下腺的分泌功能;而IPC可有效改善上述变化，对下颌下腺I/R损伤具有保护作用。其机制与上调下颌下腺M受体表达、保护下颌下腺紧密连接结构有关。

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Protective effect and mechanism of ischemic preconditioning on rat submandibular gland after ischemia-reperfusion injury

SUN bin1，GAO Jun-tian，SHI Liang，SONG Dai-hui，WEI Feng-cai
(1 School of Stomatology，Shandong University，Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Biomedicine，Jinan 250012，China)

Abstract:Objective To observe the protective effect of ischemic preconditioning (IPC) on the rat submandibular gland after ischemia-reperfusion (I/R) injury and to investigate the mechanism.Methods Forty-eight healthy male Wistar rats were randomly divided into the observation group and model group，24 in each group.The right glands of rats in both groups received the I/R injury to make the I/R injury models.The glands of the observation group were obtained by 3 min of ischemia，followed by 3 min of reperfusion，and we performed three times before modeling.The left glands were taken as the control group.Salivary secretion，histological changes，alternations of tight junctions (TJs) and mACh-receptor levels in 6 rats were detected at different time points (1 h，12 h，24 h and 72 h after I/R).Results In the control group，the salivary secretion，histological changes，alternations of tight junctions (TJs) and mACh-receptor expression levels were all normal.In the model group，the secretion of the glands significantly decreased after I/R 1 h and 12 h，and it showed a slightly lower in the observation group.The secretion of both groups gradually increased at 24 h and got back to normal at 72 h after reperfusion.Cellular atrophy，inflammatory cells infiltration，tissue edema，the collapse and reduced widths of TJs were observed especially after reperfusion for 12 h in the model group，a little part showed the status and the reaction was lighter in the observation group.The level of mACh-receptor exhibited the same tendency，and lower mAChreceptor levels at 12 h after reperfusion were observed in the model group; while in the observation group，it gradually returned to normal.ConclusionIPC has the protective effect on the rat submandibular gland after I/R injury，whose mechanism may be related with the down-regulation of mACh-receptor and protection of TJs.

Key words:ischemic preconditioning; ischemia-reperfusion; submandibular glands; transplantation of submandibular glands; keratoconjunctivitis sicca

(收稿日期:2014-12-04)

通信作者:宋代辉

基金项目:山东省自然科学基金资助项目(ZR2010HM037)。

文章编号:1002-266X(2015)18-0027-03

文献标志码:A

中图分类号:R322.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.009