基因检测叶酸利用能力的个体差异性临床观察

魏海青 郭燕 胡殿珍 罗环

叶酸(Folic acid)维生素B复合体之一，是米切尔(H.K.Mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。是合成核酸所必需的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。有“优生优育的营养素”美誉，对孕妇尤其重要［1］。1997年卫生部开始推荐孕女性性统一补充叶酸，剂量为400 μg/d。该措施在出生缺陷预防中起了重要作用，但由于孕妇对叶酸的代谢能力不足，出生缺陷的发生率仍存在很大的地域差异。对于叶酸代谢能力正常的孕妇来说，每天补充400 μg叶酸是足够的，但是对叶酸代谢能力存在障碍的孕妇来说，应该相应增加补充剂量，并加强孕期各项检测。据我国婚前育龄女性血清抽样调查发现，我国城市和农村女性缺乏叶酸者分别有21%和38%。而孕妇由于摄入不足、胎儿需要量大、尿中排除量比平时多等原因更容易缺乏叶酸。据卫生部及疾控中心相关报告，我国每年将有90万新生儿缺陷性疾病诞生，患出生缺陷排在前5位的包括:先天性心脏病，神经管畸形，唇腭裂，唐氏综合征，多指(趾)，这些多与孕妇叶酸缺乏有一定关系。当前，为了降低新生儿出生缺陷，孕妇妊高症和流产的发病率，临床上根据卫生部推荐孕期女性统一补充叶酸的剂量为400 μg/d，但由于每个人叶酸能力代谢不同，利用能力也出现差异，仍然出现一定数量的新生儿缺陷性疾病。因此通过基因位点检测，个性化补充叶酸，特别是研究基因突变则是探讨这些疾病发生机制的关键。利用现代基因分型技术检测孕母叶酸代谢相关基因，根据基因分型结果对受检者叶酸利用能力进行分级，进而针对性的调整叶酸补充剂量具有深远的意义。［2］

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择在2014年1月至12月对河北省丰宁满族自治县计划生育技术服务站和北京市预防医学研究中心进行了叶酸利用能力遗传基因检测的围孕期女性400例，年龄21～40岁，以上病例均由指定几家医院及计划生育研究所提供相关调查表并跟踪记录。按照有无不良孕史分为有不良孕史的为观察组(n=68)，无不良孕史为对照组(n=332)。观察组21～25岁22例，26～30岁26例，31～35岁10例，36～40岁2例。对照组21～25岁68例，26～30岁196例，31～35岁46例，36～40岁22例。同时也进行了对个体化叶酸补充相关知识的了解情况的调查，对这68例有不良孕产史的围孕期女性的个体化叶酸补充知识了解情况进行统计，了解叶酸个体化补充相关知识的32例，不了解的36例;对这332例有不良孕产史的围孕期女性的个体化叶酸补充知识了解情况进行统计，了解个体化叶酸补充相关知识的占172例，不了解的占160例。

1.2. 检查方法:采用咽拭子法。让受检者用0.9%氯化钠溶液漱口2次后，通过采样器咽拭子在被检者口腔黏膜刮取脱落细胞，提取DNA，采用Taqman-MGB技术，对亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因-C677T、A1298C和MTRR基因位点-A66G的单核苷酸多态性分型进行荧光定量PCR检测，相关仪器、试剂均为美国ABI公司产品。

1.3 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光定量PCR结果 经终点荧光读取，区分检测样本携带的不同基因型(杂合、野生纯合、突变纯合)，经实验室数据综合，以上每个检测样本的三个基因位点数据均被采集。

2.2 叶酸利用能力遗传检测相关结果统计情况

2.2.1 叶酸利用能力遗传检测基因型情况:叶酸利用能力遗传检测基因型情况包括杂合型、野生纯合型［3］、突变纯合型。关于MTHFR基因位点C677T上的基因型常见的有CC(正常)，CT(正常)、TT(风险)，其中TT风险基因型在我国人群中所占比例为28%;关于MTHFR基因位点A1298C上的基因型常见的有AA(正常)、AC(正常)、CC(风险)，其中，CC 风险基因型在我国人群中所占比例为4%;关于MTRR基因位点A66G上的基因型常见的有AA(正常)、AG(正常)、GG(风险)，其中GG风险基因型在我国人群中所占比例6%。见表1。

表1 叶酸利用能力检测基因型情况

2.2.2 叶酸利用能力风险等级情况:根据各基因位点功能、纯合、杂合及出现频率，叶酸利用能力风险等级情况一般分为七级，其中零级为未发现风险，表明叶酸利用能力正常;一级和二级为低度风险，表明叶酸利用能力略差;三级、四级和五级为中度风险，表明叶酸利用能力较差;六级和七级为高度风险，表明叶酸利用能力很差。见表2。

表2 叶酸利用能力基因检测风险等级情况

2.2.3 观察组与对照组叶酸利用能力统计情况:根据叶酸利用能力基因检测中基因分型结果，对受检者叶酸利用能力进行分级，统计结果如下:观察组68例患者中，叶酸利用能力正常的为1例，占1.47%;叶酸利用能力略差的为8例，占11.76%;叶酸利用能力较差的为49例占72.06%;叶酸利用能力很差的为10例，占14.71%。对照组332例患者中，叶酸利用能力正常的为50例，占15.06%;叶酸利用能力略差的为112例，占33.73%;叶酸利用能力较差的为146例占43.98%;叶酸利用能力很差的为24例，占7.23%。结果发现，2组患者叶酸利用能力级别情况(正常、略差、较差、很差)比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 2组叶酸利用能力级别情况对比 例(%)

2.2.4 个体化补充叶酸参考量:对MTHFR基因、MTRR基因及其相关位点的检测，可以直接发现被检测者叶酸代谢方面的遗传缺陷(即叶酸的利用能力)，从而根据风险高低(相关代谢酶的活性程度)建议更准确的补充剂量，例如:对于叶酸利用能力基因检测结果正常的孕龄女性，在孕前3个月至孕早期补充400 μg/d，孕后期注意食物补充就可以了;对于检测结果略差的注意孕前3个月、孕早期、孕中及后期坚持补充400 μg/d;对于检测结果较差的孕龄女性，注意孕前3个月补充 400 μg/d，而孕早期注意增加到800 μg/d，孕中及后期 400 μg/d;对于检测结果很差的孕龄女性，注意在孕前3个月及孕早期均补充800 μg/d，孕中及后期补充 400 μg/d。由中国疾病预防控制中心妇幼保健中心组织的孕龄女性(孕前3个月、孕早期、孕中/孕后期)叶酸利用能力检测所提供的增补参考量情况。见表4。

表4 叶酸利用能力基因检测提供的增补参考量情况 μg/d

3 讨论

叶酸作为水溶性B族维生素中的一种，过去认为它主要是参与造血。但随着对其研究的深入，它的缺乏与多种疾病有关，特别与孕妇和新生儿疾病有着密切的关系。导致机体缺乏叶酸有两个方面的原因:(1)叶酸摄入量不足，(2)由于遗传(基因)缺陷导致机体对叶酸的利用能力低下即叶酸代谢通路发生障碍。而叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因，应引起对孕妇叶酸利用能力检测的高度重视。［4］

国外通过基因位点检测，评估叶酸利用能力的强弱，个体化指导孕龄女性补充叶酸的研究开展较早，并收到很好的孕妇和新生儿疾病预防效果。但由于人种、遗传因素、环境因素、饮食因素等的差异，有必要根据我国孕龄女性的现状，进一步开展这方面的研究［5］。有相关叶酸利用能力遗传(基因)检测涉及的基因和位点的研究显示:MTHFR全称5，10-methylenetetrahydrofolatereductase(5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶)基因的C677T位点上的基因型有以下三种，CC(正常);CT(正常);TT(风险)，三种基因型在中国人群中所占比例分别为22%;50%;28%。MTHFR基因的A1298C位点上的基因型也有三种，AA(正常);AC(正常);CC(风险)，三种基因型在中国人群中所占比例分别为66%;31%;4%。MTRR基因全称5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase，编码甲硫氨酸合成酶还原酶，该基因的A66G位点上的三种基因型为AA(正常);AG(风险);GG(风险)，三种基因型在中国人群中所占比例分别为58%;36%;6%。综上所述，通过对MTHFR基因、MTRR基因及其相关位点的检测，可以直接发现被检测者叶酸代谢方面的遗传缺陷(即叶酸的利用能力)［6］，再依据以上各基因位点的功能、纯合、杂合及其出现频率可以进行风险分级，从而根据风险高低(正常、略差、较差、很差)建议个体化补充剂量。

近年来，不育不孕与新生儿出生缺陷发生率呈逐年上升趋势，引起了医疗及政府相关部门的高度重视［7］。中国疾病预防控制中心妇幼保健中心于2007年先后三次向全国妇幼保健院发出关于开展“妇幼保健遗传检测服务项目”的函，指出:“为了提升妇幼保健服务的技术含量，将最新的预防检测技术及时应用于妇幼保健服务。”首期推出了以“孕期叶酸需求遗传检测”为代表的15项“妇幼保健遗传检测服务项目”。

目前，国内部分省市虽然已经有关于叶酸利用能力基因检测个体化指导孕妇补充叶酸的相关报道，但还不够系统和全面，特别是缺乏通过叶酸利用能力基因检测孕龄女性分阶段个体化补充叶酸全过程的跟踪调查结果还尚无相关报道［8］。通过基因检测技术手段，对人体MTHFR基因及MTRR基因做检测，可以及早发现不同个体对叶酸的吸收利用水平［9］，从而筛查出容易引起叶酸缺乏的高危人群，实现个性化增补叶酸，同时加强产前检查，以降低新生儿出生缺陷风险［10］。因此，需要不断开展系列研究，特别是有关某些基因多态性的研究，有科学意义和实用价值。

以上叶酸利用能力基因检测结果显示:观察组的有不良孕产史组患者叶酸利用能力较差或很差所占比例明显高于对照组的既往无不良孕产史患者(P＜0.05)。而对照组患者叶酸利用能力也存在明显的个体差异。

因此，过去采用补充相同剂量的叶酸预防孕妇及新生儿缺陷性疾病有一定的局限性，建议围孕期女性通过叶酸利用能力的遗传基因检测有针对性的调整叶酸补充剂量。

1 Lamb NE，Yu K，Shaffer J，et al.Association between mater-nalage and meioticre combination fortrisomy.Am J Hum Genet，2005，76:91.

2 Popiela A，Keith G，Borzecki A，et al.The meaning of themehylation of genomic DNA in the regulation of gene expres-sionlevels.Eur J Gynaecol Oncol，2004，25:145.

3 贺宪民，张群，杨琦，等.亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性研究.中国计划生育学杂志，2010，19:35-37.

4 郑山，白亚娜，胡晓斌，等.孕产妇叶酸知晓途径及其家人对服用叶酸影响.中国公共卫生，2011，27:45-47.

5 张亲凤，林燕玲，薛燕燕，等.荧光定量PCR用于孕妇叶酸利用能力检测研究.中国热带医学，2010，10:32-35.

6 何燕霞，巩姣梅，沈勇，等.河南育龄女性叶酸利用能力现状研究.实用检验医师杂志，2012，4:6-10.

7 陆云凤.240例孕妇在孕前、孕早期叶酸服用情况的回顾性调查分析.中国妇幼保健，2006，21:19-21.

8 张春丽，张宁.2012年玉林市农村适龄女性孕前和孕早期叶酸服用情况调查分析.包头医学，2014，38:95-97.

9 陈久霞，李岐佩，姚聪，等.406例围孕期女性叶酸服用状况调查.中国妇幼健康研究，2013，24:432-434.

10 徐亚男，吴艳乔，吕行，等.四川省孕期女性叶酸的认知、服用状况及影响因素分析.现代预防医学，2013，40:3009-3011.