壳聚糖及其衍生物在黏膜免疫中的应用与展望

刘洪斌 杨万秋/哈药集团生物疫苗有限公司宇璐 康宏 赵凯/黑龙江大学生命科学学院微生物黑龙江省高校重点实验室



壳聚糖及其衍生物在黏膜免疫中的应用与展望

刘洪斌 杨万秋/哈药集团生物疫苗有限公司
宇璐 康宏 赵凯/黑龙江大学生命科学学院微生物黑龙江省高校重点实验室

免疫途径可分为肌肉注射、皮下注射、口服和鼻腔等，产生的免疫应答类型包括细胞免疫，体液免疫及黏膜免疫。在当今临床中，疫苗的接种方式主要还是通过肌肉注射给药，该给药途径虽可以刺激免疫系统在血清中产生抗体，但是抗原表达量低，不能产生黏膜免疫反应，免疫效果并不理想。壳聚糖是一种有免疫调节作用的葡聚糖，壳聚糖作为黏膜免疫的载体，能够增强疫苗的免疫原性，提高机体的体液免疫和细胞免疫的水平。佐剂是指能够增强机体的抗原免疫应答或改变了免疫应答类型的物质。它主要通过免疫调节、抗原呈递、细胞毒性T淋巴细胞诱导、抗原靶向等方式诱发机体产生了高效、长期的免疫反应，来提高对机体的保护能力，同时又减少了免疫物质的用量，进而降低疫苗的生产成本。因为壳聚糖无抗原免疫性、生物相容性优良、来源广泛、价格低廉等特点，使其成为一种理想的疫苗佐剂载体。本文围绕对壳聚糖及其衍生物相关的载体和佐剂在黏膜免疫方面的应用进行综述。

（一）壳聚糖及其衍生物的理化性质

1.壳聚糖的理化性质。壳聚糖是甲壳类动物（如虾、蟹）、昆虫和其它无脊椎动物外壳中的甲壳质在碱性条件下经脱乙酰化制得的一种天然高分子多糖体。这会出现一系列的脱乙酰程度和不同相应的相对分子质量。一般来说，脱乙酰度大于50%时，就可成为壳聚糖。壳聚糖本身是一种弱碱，Pka为6.2～7.0，在酸性条件下，壳聚糖氨基经质子化后可溶于水，并带有正电荷，使其电荷密度大。在碱性和中性环境下不溶解，但可能与有机或无机酸形成盐。壳聚糖是由葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺组成的多糖，是带阳电荷的线性多糖，有良好的生物相容性和生物可降解性，其分子中的葡糖胺基荷正电，与荷负电的DNA可产生静电作用，凝聚为多聚体复合物。壳聚糖的分子量可为几万甚至几十万，其阳离子特性可以很好的结合带负电的蛋白或者DNA，所以被认为是一个很好的蛋白，既能结合蛋白/DNA，又能避免蛋白/ DNA的降解。壳聚糖骨架上丰富的羟基和氨基使其易于化学修饰，能增加其增加其靶向性，除此之外壳聚糖还有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纤性和保湿性。

2.壳聚糖衍生物的理化性质。壳聚糖通过化学改性，可以得到具有一定官能团的壳聚糖衍生物。衍生物的性能，与壳聚糖相比，往往有较明显的改善。对壳聚糖的衍生物研究较多的有，壳聚糖的酰基化、烷基化、硫酸酯化、羟基化、季铵化、羧甲基化等，其中硫酸酯化、季铵化、羧甲基化的产物由于具有良好的水溶性而备受重视。

（1）酰基化。壳聚糖可与多种有机酸的衍生物如酸酐、酰卤等反应，引入不同分子量的芳香族酰基（苯甲酰、邻苯二甲酰基等）或脂肪（丁酰、十二烷酰及马来酰等），可大大改善产物在邮寄溶剂中的溶解度。酰化反应既可在羟基上发生，生成脂，也可在氨基上发生，生成酰胺，酰化产物的生成与溶剂、酰基结构及催化条件有关。

（2）烷基化。由于壳聚糖结构中存在氨基和羟基，因此可在N或O上发生烷基化反应，其相应的产物分别为N-烷基壳聚糖、O-烷基壳聚糖或N，O-烷基壳聚糖。

N-烷基壳聚糖衍生物的合成，通常是采用壳聚糖分子中的氨基和醛反应形成的席夫碱，然后再用NaBH4或NaBH3CN还原得到。用这种方法合成的产物，能够对各种金属离子有很好的吸附和螯合能力。O-烷基壳聚糖衍生物的常见合成方法有：①N-邻苯二甲酰化法：用此反应保护氨基，在使之与卤代烷烷基化反应，随后用肼脱去保护基，既得O-烷基壳聚糖衍生物；②金属模板合成法：将壳聚糖与金属离子进行络合反应，保护-NH2和C3位上的-OH，在与卤代烷烷基发生基化反应，然后用稀酸反复洗涤处理，得到C6位上的O-烷基壳聚糖衍生物；③希夫碱法：通过壳聚糖与醛反应生成席夫碱，在将其与卤代烷烷基化反应，之后在醇酸中脱去保护基，既得O-烷基壳聚糖。N，O-烷基壳聚糖衍生物的合成，当在碱性条件下时，壳聚糖与卤代烷可直接反应，制备出在N，O位同时取代的衍生物。此类的衍生物具有较好的生物相容性，可在医药材料方面应用。

（3）硫酸酯化。根据壳聚糖硫酸酯化前的状态不同，可分为两类：第一类是根据所要制备的壳聚糖硫酸酯化衍生物的特殊要求，对壳聚糖进行预处理，可以通过活化、降解或者是对糖单元上的某一个或多个官能团进行化学修饰并加以保护，实施定位硫酸酯化，即将不同的预处理方法和壳聚糖硫酸酯化的方法相结合，就能得到符合要求的壳聚糖衍生物。第二类是壳聚糖没有经过预处理，直接对壳聚糖进行硫酸酯化。

进行硫酸酯化试剂的选择主要是根据反应装置的情况和控制反应过程的难易程度。所用的试剂主要有氯磺酸，浓硫酸，二氧化硫-三氧化硫，从理论上来讲，三氧化硫是最有效的试剂。壳聚糖硫酸酯结构的多样性也为我们提供了多种生理功能。

（4）羟基化。壳聚糖羟基化衍生物的合成一般是在碱性介质中进行的，在碱性条件下，壳聚糖可与环氧乙烷和环氧丙烷直接反应，最后得到N，O位取代的衍生物。用缩水甘油或32氯21，22丙二醇也可进行羟基化反应，通过进一步反应就可在壳聚糖的分子中引入两个羟基。通常来说，壳聚糖衍生物具有良好的水溶性和生物相容性，它也同时具有高分子和表面活性剂的两大特点，可以成为一种优异的新型高分子表面活性剂。

（5）季铵化。壳聚糖的季铵化衍生物可以分为两类：一类是根据壳聚糖氨基的反应来制得 ，具体方法是使用过量卤代烷和壳聚糖反应得到卤化的壳聚糖季铵化衍生物。另一类是用含有环氧烷烃的季铵盐和壳聚糖进行反应 ，得到含有羟基的壳聚糖季铵化衍生物。该衍生物不仅有很好的杀菌性能，还可以作为污水处理剂，絮凝剂以及表面活性剂。

（6）羧甲基化。近几年关于壳聚糖羧甲基化衍生物的报道越来越多，羧甲基壳聚糖是指，壳聚糖分子在不同的条件下，将羧甲基引入到分子链上，即壳聚糖与乙醛酸或氯代烷酸进行反应。因为引入羧基后可以得到完全水溶性的高分子，更重要的是可以得到含阴离子的两性壳聚糖衍生物。根据羧甲基的取代位置不同，O-羧甲基壳聚糖，N-羧甲基壳聚糖，O，N-羧甲基壳聚糖三种衍生物。该类衍生物可在多方面得到应用，特别是作为药物载体方面。

总之，壳聚糖具有以上的优良特点。这些特点也决定了壳聚糖及其衍生物作为载体和佐剂对黏膜免疫在医药、免疫学等领域的重要的应用价值。

（二）壳聚糖及其衍生物在黏膜免疫方面的应用

1.黏膜免疫。黏膜免疫一般是将抗原和携带抗原的复合物通过口服、鼻腔给药等方法进行免疫。一方面可在局部的黏膜表面产生针对目的抗原的免疫球蛋白，另一方面又刺激机体产生全身性免疫，进而在整体上起到防御作用。现阶段有多种免疫给药方式，其中的黏膜免疫与其他方式相比有着更显著的优势，比如成本低、顺应性较好、患者易接受等方面。

（1）口服免疫。口服免疫简单易行，是理想的黏膜免疫途径之一。疫苗口服免疫主要面对两大屏障：形态学屏障和胃肠道的生理学屏障。其中，形态学屏障对激活免疫应答起关键作用。有利于在有效接种部位富集基因疫苗，增加免疫原性。生理学屏障包括了各种酶和胃酸对疫苗的降解。通过采用了微粒包裹活性形式的疫苗，保护pDNA，避免各种酶和胃酸破坏导致过早失活。同时提高疫苗了的靶向性，增加对M细胞的摄取量，从而达到局部或全身黏膜免疫的效果。

（2）鼻黏膜免疫。鼻腔作为免疫部位具有以下生物学特征：①给药方便：可以以滴入或喷入发的方式给药，患者可以自己完成；②促进药物的吸收：鼻腔的黏膜上存在许多细微绒毛，也有丰富的淋巴管和毛细血管，有效的增加了药物吸收的面积，使药物更容易被鼻黏膜吸收；③避免了胃肠道酶和胃酸的降解：药物经鼻黏膜吸收之后，直接进入人体循环，提高了药物的利用率。

与口服免疫相比，鼻黏膜免疫的传输距离短，鼻腔内pH为6.5～7.0，水解酶的种类和数量小于胃肠道，所以不会受到酶和酸的降解，免疫疫苗的吸收不受食物影响，给药疫苗可以包裹也可不用包裹在微粒中。而且，鼻黏膜较其他部位的黏膜，不规则度更高，更具有渗透性。

2.壳聚糖作为黏膜疫苗载体、佐剂。

（1）壳聚糖作为黏膜疫苗载体。壳聚糖作为黏膜疫苗载体，具有良好的低毒性、生物相容性及促渗作用。它能与活体的组织相容，被体内的胃蛋白酶降解后，人体能够完全的吸收降解产物，无毒、副作用。壳聚糖还具有良好的免疫刺激活性、凝结能力、控制药物释放、提高疏水性药物的稳定性、延长药物疗效及改变给药途径，还可以加强制剂的靶向给药能力。根据上述生物特性，壳聚糖在黏膜疫苗载体中得到了广泛的应用。

壳聚糖作为黏膜疫苗载体的作用如下：①促渗作用：壳聚糖可使黏膜上皮细胞的蛋白结构发生改变，从而提高了黏膜的通透性，促进了蛋白抗原分子的跨黏膜吸收；将壳聚糖及其衍生物作用于细胞单层，可促进抗原疫苗通过细胞旁路进入体内，增强其渗透吸收，提高生物利用度；②黏膜吸附特性：壳聚糖分子中的氨基和羟基能与黏膜中带负电荷的糖蛋白形成氢键，产生黏附作用，延缓了对抗原的清除，使抗原更易穿过黏膜屏障，进而与淋巴组织作用，引起局部或全身的黏膜免疫反应。

壳聚糖可以被制成不同的形态，如微球、纳米粒子、条状颗粒及薄膜。可以采用多种方法来制备壳聚糖微粒：①复凝聚法：利用带正电荷的壳聚糖和带负电荷的聚合物互相作用的特点，复凝聚制得壳聚糖微粒；②交联法：利用壳聚糖的氨基和其他化合物相应活性基团发生反应的特点，交联制得壳聚糖微粒。在乳剂中的微粒可通过乳液分离、溶剂蒸发等方法得以分离；③喷雾剂干燥法：通过喷雾干燥设备制得壳聚糖微粒；④疏水修饰自聚集法：将壳聚糖用化学试剂进行疏水修饰，其在水溶液中形成自聚集体；⑤沉淀法：与疏水修饰自聚集法相似，将壳聚糖用沉淀剂进行沉淀，制得壳聚糖微粒。其中复凝聚法和和交联法是制备壳聚糖微粒最常用的两种方法。

（2）壳聚糖黏膜免疫佐剂。黏膜佐剂是一类与抗原预先或同时应用，增强机体对抗原性的免疫应答，来增强相应抗原的免疫原性。壳聚糖在黏膜免疫中的佐剂效应：疫苗经黏膜免疫产生的免疫反应通常不能达到理想的免疫效果，所以必须依赖一些有效的黏膜免疫佐剂，其能够提高T细胞、B细胞、浆细胞、巨噬细胞、多形核细胞及嗜酸性粒细胞的活性和积聚能力，诱导细胞因子的产生，激发有效的T细胞免疫应答。其自身还可引起IL-10的释放及黏膜IL-4的表达，激活脾脏的T细胞，黏膜Th2免疫反应明显上调。理想的疫苗佐剂应当具备以下的特点：①必须安全有效；能够有效诱导或增强细胞免疫；③应具有稳定的活性，本身可降解，无免疫原性。

（3）壳聚糖微粒作为黏膜载体、佐剂免疫中有的应用。

Alpar等研究发现，牛血清白蛋白在加入壳聚糖微球后与不加壳聚糖相比较，其能诱导更多的抗原特异性的IgG抗体反应；Mohaghegh等研究表明，lgG和lgA抗体，纳米粒免疫组与对照组相比较，其免疫反应水平显著提高；Biswas 等研究证明，涂有藻酸盐的纳米颗粒，制剂经小鼠口服，结果显示了覆载麻疹抗原的纳米颗粒诱发强烈的免疫反应。全身黏膜免疫应答和低细胞毒性，可以证实藻酸盐纳米颗粒经口服的方式，可作为新型的黏膜载体。Yao等研究表明，将甘露糖基脱乙酰纳米颗粒，进行鼻内给药，评估抑制小鼠前列腺肿瘤细胞的生长功效，经检测，发现抑制功效显著提高。所以该纳米颗粒是一种有效的抗肿瘤免疫治疗的载体。

Bento等研究发现，新型的疫苗佐剂C40/48相关的壳聚糖纳米粒子，该纳米颗粒可促进细胞摄取，延长抗原在鼻腔的停留时间，有利于免疫应答。Moon等研究重组流感病毒血凝素抗原与纳米颗粒组成的壳聚糖作为黏膜佐剂，通过鼻腔给药的方式，诱发防止高致病性流感病毒。它可以作为临床应用中一种有效的安全性的黏膜佐剂。

（三）展望

壳聚糖有着特殊的生物和理化性质，是极有潜力的新型疫苗载体佐剂，近年来对壳聚糖及其衍生物在黏膜免疫方面做了许多的研究，也取得了很大的进展。但是，科研应是不断的去探索、进步、发展。今后，对于如何开发新型的载体佐剂，选择合适、安全的改性材料，减少制备过程的复杂程度，增强对黏膜免疫稳定性及放大生产等等，都有待进一步的解决。相信在不久的将来，壳聚糖等疫苗载体、佐剂在疾病防治中发挥最大的功效。

参考文献（略）