不同贮藏方法对桃叶卫矛种子萌发和营养物质的影响1)

宋红 李万义 丁格根其尔 王玲

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

桃叶卫矛(Euonymus bungeanus Maxim．)又名丝绵木、白杜，是卫矛科卫矛属落叶小乔木;树冠卵圆形，小枝细长，绿色光滑，树干人字形开裂。叶对生，卵状椭圆形，长3 ～7 cm，先端急长尖，叶缘有细齿。花淡绿色，花瓣4，聚伞花序腋生。蒴果粉红色，4 深裂，具橙红色假种皮［1］。桃叶卫矛是我国分布广泛的树种之一，北起黑龙江、内蒙古各省区，南到长江南岸各省区;除两广地区未见野生种外，其他各省区均有野生资源存在，长江以南地区常以栽培为主;国际上分布也较为广泛，如乌苏里地区、西伯利亚南部和朝鲜半岛等［2］。桃叶卫矛适应性强，耐荫，耐干旱、水湿，有较强的耐寒能力;根萌蘖力强。树姿优美，秋季果实挂枝梢，开裂后露出橘红色假种皮，引人注目;可种植于湖岸、溪水边成水景，种植于草坪、林缘、路旁做庭荫树或孤赏树;也可做工厂绿化及防护林［3］。根及树皮含有硬橡胶;种子含油量高，刘慧娟［4］在对内蒙古非粮油脂植物资源的调查中发现，桃叶卫矛是被调查的82 种木本油脂植物中产油潜能最高的3 种植物之一，由此可见桃叶卫矛在未来具有较高的开发利用价值。

1 材料与方法

于2011 年10 月采收于哈尔滨市生长状况良好的桃叶卫矛树，经自然干燥，去外种皮，测得种子含水量为8%。

仪器设备:MGC-400B 型智能型光照培养箱、BS323S 电子天平d=0．001 g、烘干箱、索氏提取器、恒温冰箱(-20 ℃)、KDM 型调温电热套、RE-52A旋转蒸发仪、SHZ-III 型循环水真空泵、B260 恒温水浴锅、Agilent 7693 气相色谱仪。

发芽率的测定:发芽率按GB 2772—1999《国家林木检验标准》［5］进行测定。

脂肪测定方法:含油率按GB 2906—82《谷类、油料作物种子粗脂肪测定方法》［6］进行测定。

种子油脂肪酸甲酯制备:参照GB/T 17376—2008《动植物油脂、脂肪酸甲酯制备》［7］中的酯交换法进行制备。

色谱柱:Agilent Technologies7693，30 m×0．25 mm×0．25 μL 石英毛细管柱;载气氮气。

柱温100 ℃保持2 min，以10 ℃/min 的速度升至160 ℃保持2 min，再4 ℃/min 的速度升至200 ℃保持2 min，2 ℃/min 的速度升至250 ℃保持3 min;检测器温度250 ℃，柱子温度250 ℃，分流液体积比50 ∶1，柱流速1 mL/min，进样量1 μL。

可溶性糖质量分数测定采用标准曲线的制作［8］。

1%蔗糖标准液采:称取烘至恒质量的分析纯蔗糖1 g，转入100 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。100 μg/L 蔗糖标准液:取1%蔗糖标准液1 mL加入100 mL 容量瓶中，定容至刻度。

取6 支25 mL 试管，按表1 加入溶液和水。

表1 不同样品中蔗糖加入量

可溶性蛋白测定:考马斯亮蓝法测定蛋白质质量分数［9］。蛋白质和加入量见表2。

表2 不同样品中蛋白质加入量

数据处理方法:运用Excel 及Spss19．0 软件进行数据统计分析、方差分析及差异性分析，并釆用LSD 法进行多重比较。

2 结果与分析

2．1 种子贮藏过程中发芽率的变化

贮藏2 a 后，不同温度和不同贮藏方法对桃叶卫矛种子发芽率的影响结果如表3 所示。布袋贮藏种子在25 ℃下贮藏2 a 后，与其他贮藏方法相比，发芽率最低且下降速度最快，发芽率与贮藏前相比降低了96%。5 ℃条件下，锡纸袋和密封罐贮藏种子发芽率无显著差异，发芽率下降速度与布袋贮藏相比较缓慢，发芽率与贮藏前相比分别降低了50%和47%。-20 ℃条件下，锡纸袋和密封罐贮藏种子发芽率无显著差异，发芽率下降最缓慢，与贮藏前相比分别降低了46%和43%。从表3 还可以看出，锡纸袋和密封罐贮藏种子在5、-20 ℃条件下发芽率差异并不显著，而与布袋贮藏种子发芽率差距较大。从贮藏2 a 桃叶卫矛种子发芽率看，低温密封贮藏能有效减缓桃叶卫矛发芽率的下降。贮藏2 a 后，温度和贮藏方法对桃叶卫矛种子发芽率双因素方差分析结果如表4 所示。从表4 可以看出，桃叶卫矛种子发芽率受不同温度和贮藏方法的影响非常明显，差异达到极显著水平。

表3 不同贮藏温度下桃叶卫矛种子发芽率

表4 桃叶卫矛种子发芽率方差分析

2．2 种子贮藏过程营养物质的变化

2．2．1 索氏提取方法对种子粗脂肪提取率的影响

桃叶卫矛种子粗脂肪提取率受温度、时间两个条件的共同影响结果如表5 所示。从表5 中的数据可以看出，不同温度、不同提取时间对桃叶卫矛种子粗脂肪提取率的影响各不相同。40 ℃提取条件下，随着提取时间越长，提取率就越高;60 ℃提取温度下，随着提取时间越长，先升高，后下降;80 ℃高温条件下，提取时间越长，提取率越降低。4 h 提取时间下，提取率从高到低的顺序为:80、60、40 ℃;6 h 提取时间下，提取率从高到低的顺序为:60、80、40 ℃;8 h 提取时间下，提取率从高到低的顺序为:60、80、40 ℃。

表5 不同提取方法对桃叶卫矛种子粗脂肪提取率的影响

提取温度和提取时间对桃叶卫矛种子粗脂肪提取率有显著影响。提取温度过高、提取时间过长，分解种子油中的成分，使种子油发生质变;提取温度过低、时间短，不能完全提取种子中的粗脂肪。桃叶卫矛最高提取率41．69%(60 ℃、6 h)与最低提取率35．47%(40 ℃、4 h)相差6．22%，差异达到极显著水平。桃叶卫矛索氏提取最佳条件为:60 ℃、6 h、石油醚提取。

2．2．2 种子贮藏过程中粗脂肪质量分数的变化

贮藏2 a 后，温度和贮藏方法对桃叶卫矛种子粗脂肪质量分数影响结果如表6 所示。

表6 不同贮藏条件2 a 桃叶卫矛种子粗脂肪质量分数

从表6 可看出，相同贮藏条件下，-20 ℃和25℃贮藏种子粗脂肪质量分数差异显著;如布袋种子差异为7%。在相同温度条件下，布袋种子贮藏1 a内，粗脂肪质量分数变化较缓慢，1 a 过后，含量迅速下降，与其他两种贮藏方法下的粗脂肪质量分数差距明显。温度与种子粗脂肪质量分数成正比，且贮藏方法对粗脂肪质量分数影响显著。从表6 还可看出，贮藏种子2 a 后，布袋种子在各个温度下(25、5、-20 ℃)粗脂肪质量分数分别比贮藏前降低了33%、23%、16%。25 ℃各个贮藏方法(布袋、锡纸袋、密封罐)粗脂肪质量分数分别比贮藏前降低了33%、17%、20%。25 ℃、布袋和-20 ℃、锡纸袋贮藏种子粗脂肪质量分数分别是贮藏前的67%和92%。

方差分析结果(表7)表明，贮藏温度、贮藏方法、贮藏温度和方法综合影响对桃叶卫矛种子粗脂肪质量分数差异达到极明显水平。

表7 桃叶卫矛种子粗脂肪质量分数方差分析

2．2．3 种子贮藏过程中脂肪酸成分变化贮藏2 a 后提取桃叶卫矛种子粗脂肪，用KOH—甲醇溶液方法对粗脂肪脂肪酸进行甲酯化制备，采用气相色谱—质谱(GC—MS)方法测定粗脂肪脂肪酸组成成分及质量分数。用面积归一法计算种子粗脂肪中的相对脂肪酸质量分数，结果如表8所示。从表8 可看出，硬脂酸质量分数由高到低的顺序为:25 ℃布袋、-20 ℃锡纸袋、新种子;油酸和亚油酸量由高到低的顺序为:新种子、-20 ℃锡纸袋、25 ℃布袋。贮藏2 a 种子与新种子相比，油酸和亚油酸量明显降低，硬脂酸量增高，还出现了反油酸和反亚油酸。

表8 不同贮藏条件对桃叶卫矛种子脂肪酸质量分数的影响

2．2．4 种子贮藏过程中可溶性蛋白质量分数的变化贮藏2 a 后，温度和贮藏方法对桃叶卫矛种子可溶性蛋白影响结果如表9 所示。

表9 不同贮藏条件桃叶卫矛种子可溶性蛋白质量分数

贮藏种子2 a 后，5 ℃和-20 ℃贮藏种子可溶性蛋白质量分数高，25 ℃贮藏桃叶卫矛种子可溶性总糖质量分数低。在相同温度条件下。各个贮藏方法种子可溶性蛋白质量分数差异明显，达到显著水平。温度与种子可溶性蛋白质量分数成正比，且贮藏方法对可溶性蛋白质量分数影响明显，其中锡纸袋贮藏种子可溶性蛋白降低最慢。

对贮藏2 a 后种子可溶性蛋白质量分数方差分析结果(表10)表明:贮藏温度对桃叶卫矛种子可溶性蛋白质量分数的影响非常明显，差异达到极显著水平;贮藏方法对桃叶卫矛种子可溶性蛋白质量分数的影响明显;贮藏温度和方法对桃叶卫矛种子可溶性蛋白质量分数的综合影响非常明显，差异达到极显著水平。

2．2．5 种子贮藏过程中可溶性糖质量分数的变化

贮藏2 a 后，温度和贮藏方法对桃叶卫矛种子可溶性糖影响结果如表11 所示。贮藏种子2 a 后，可溶性糖质量分数都有所降低，其中5 ℃和-20 ℃贮藏种子可溶性糖质量分数高，25 ℃贮藏桃叶卫矛种子可溶性总糖质量分数低。可溶性糖质量分数最高(-20 ℃、锡纸袋)与最低质量分数(25 ℃、布袋)的比值大约2．1 ∶1。

表10 桃叶卫矛种子可溶性蛋白的方差分析

表11 不同贮藏条件下桃叶卫矛种子可溶性糖质量分数

对贮藏2 a 后种子可溶性糖质量分数方差分析结果(表12)表明:贮藏温度对桃叶卫矛种子可溶性糖质量分数的影响非常明显，差异达到极显著水平;贮藏方法对桃叶卫矛种子可溶性糖质量分数的影响明显。

表12 桃叶卫矛种子可溶性糖方差分析

3 结论与讨论

随着贮藏时间的延长，不同温度下贮藏种子发芽率都有下降的趋势，其中25 ℃贮藏种子发芽率下降最快，5 ℃与-20 ℃种子发芽率下降速度慢，且差异不明显。锡纸袋种子在-20、5、25 ℃温度下贮藏2 a 后，其种子发芽率分别是贮藏前的55%、50%和33%。贮藏温度对种子营养物质质量分数的影响明显，温度与可溶性蛋白、可溶性糖质量分数的变化成正相关关系，25 ℃贮藏种子后熟阶段极短，迅速进入衰老分解阶段，而5 ℃和-20 ℃种子的可溶性蛋白和可溶性糖质量分数在贮藏一定时间内先升高后下降，-20 ℃最高峰比5 ℃晚出现。不同贮藏方法下可溶性糖和可溶性蛋白质量分数从大到小的顺序为:锡纸袋、密封罐、布袋。低温、密封贮藏能防止营养物质被氧化。

桃叶卫矛种子粗脂肪质量分数为42%，最佳提取条件是:索氏提取、6 h、60 ℃，提取剂为石油醚。种子粗脂肪中含有棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等脂肪酸。25 ℃、布袋和-20 ℃、锡纸袋贮藏种子粗脂肪质量分数分别是贮藏前的67%和92%，25 ℃、布袋贮藏种子粗脂肪变浑浊。新种子在25 ℃、布袋和-20 ℃、锡纸袋贮藏条件下贮藏2 a 后，粗脂肪中的脂肪酸成分和性质发生了变化，不饱和脂肪酸相对含量减少，转化为异构体、饱和脂肪酸或其他氧化物;饱和脂肪酸相对含量也减少，但变化不是很大。5 ℃和-20 ℃贮藏种子可溶性蛋白、可溶性糖质量分数先升高后下降，-20 ℃贮藏种子最高峰较晚出现于5 ℃贮藏种子;25 ℃贮藏种子可溶性总蛋白质量分数一直下降。25 ℃贮藏种子后熟阶段极短，迅速进人衰老分解阶段，而低温可抑制衰老，延长后熟阶段的时间。随着贮藏时间延长，粗脂肪质量分数降低;脂肪酸性质发生变化，不饱和脂肪酸相对含量变少，转化为异构体、饱和脂肪酸或其他氧化物。贮藏2 a 种子与新种子相比，油酸和亚油酸相对含量明显降低，硬脂酸相对含量增高，还出现反油酸和反亚油酸现象。

种子贮藏过程中可溶性糖和贮藏蛋白的变化较为复杂，不同的环境条件下变化规律不同。种子衰老过程中，受贮藏种子含水量、环境温度、生物因子、环境湿度和通气条件等条件的不同而发生变化。在高温、高湿环境下种子新陈代谢旺盛，消耗体内糖和蛋白以维持呼吸作用，释放热量、水分，并在通气不良条件下积累种堆内，使种子发热、代谢旺盛、微生物衍生，导致种子快速失去活力，进而使得种子质量下降。脂肪是油料作物种子和果实中重要的营养物质，测定粗脂肪的质量分数、脂肪酸质量分数及成分分析，可以鉴别种子品质的优劣。贮藏条件的好坏直接影响种子脂肪含量和脂肪酸成分的变化，而脂肪含量变化、不饱和脂肪酸被氧化等都会影响种子质量。

许多研究认为细胞中的不饱和脂肪酸被氧化会引起细胞膜通透性增加，而且不饱和脂肪酸氧化形成的氢过氧化物和自由基会对膜的结构、细胞组织、蛋白质以及DNA 造成破坏，从而导致种子活力丧失［10-12］。硬脂酸是油脂水解、油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸转化产生的饱和脂肪酸。在氧化物处理下亚油酸转变为反式亚油酸，氢化时变成12-十八碳烯酸和油酸，进一步氢化变成硬脂酸。反式油酸是油酸转化而得。王玺等［13］通过对大豆种子贮藏期间活力变化规律及PEG 处理效研究提出，种子中不饱和脂肪酸氧化最终产生丙二醛，而丙二醛的积累能够引起种子膜系统的严重损伤，影响种子活力，种子质量与种子活力呈正相关，因此导致种子质量下降。种子脂肪代谢与种子活力有相关性，但也有学者认为虽然脂肪代谢能够导致种子活力丧失，但脂肪含量与种子活力相关性不大［14-15］。本试验通过新种子与贮藏2 a 种子粗脂肪质量分数和脂肪酸成分分析发现，在贮藏过程中，种子不饱和脂肪酸被氧化，发芽率和种子保护酶活性降低，有毒物质积累，营养物质减少;结果表明:种子活力即种子质量与不饱和脂肪酸有一定的相关性。

桃叶卫矛是一种集工业、药用、观赏应用于一体的植物，具有较高的推广价值。本试验通过探索桃叶卫矛种子的最佳贮藏条件，提高贮藏种子活力，进而提高种子在贮藏过程中抵抗外界不良环境条件的耐受性;实现较高的田间出苗率，有效节约播种成本;使种子具有高效的生产性能，为生产实际提供一定的参考。另外，证明桃叶卫矛种子粗脂肪中含有棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等脂肪酸，并与种子质量有一定相关性。

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