元基因组研究进展

杨 春，邓绍平

(四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610072)

元基因组研究进展

杨 春，邓绍平△

(四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610072)

元基因组学是一门直接取得环境中所有遗传物质的研究方法，主要研究通过提取某一环境中的所有微生物基因组 DNA，构建基因组文库及对文库进行筛选寻找和发现新的功能基因及活性代谢产物。它开辟了一个研究微生物多样性的新时代，打破了传统培养技术在微生物资源开发利用上的限制因素，极大地扩展了99%不可培养微生物资源的利用空间。同时也扩大了人们对环境微生物多样性的认知。目前，元基因组技术在医学、生物能源、生态环境保护和农业等方面都取得了很大的进步。本文回顾了当前发展的元基因组的研究方法及其应用。

元基因组；基因组文库；功能筛选；序列分析；生物能源；生态环境

环境微生物是自然界中分布最广、种类最多、数量最大的生物类群。早期对于微生物的研究主要是建立在纯培养的基础上，后来人们发现不能通过纯培养方法分析的环境微生物多样性占总量的99%以上[1]。随着元基因组学的发现与提出[2]，特定生物种基因组研究使人们的认识单元实现了从单一基因到基因集合的转变，元基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动规律。元基因组，也称微生物环境基因组 (Microbial Environmental Genome)，或宏基因组(Metagenomics)，包含了可培养的和不可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。元基因组的研究基于分析直接从土壤、水或粪便等样品提取的微生物DNA，其研究方法基本策略流程为：样品和基因(组) 的富集；提取特定环境中的基因组DNA；构建元基因组DNA文库；筛选目的基因；目的基因活性产物表达。目前公认的筛选方法主要有两种，即功能筛选和序列分析，这两种方法并不是相互的排斥的。基于功能筛选的元基因组研究依赖于分子克隆的构建及表达后活性产物的筛选[3，4]。构建成功的克隆基因通过序列分析，对其目的基因和表达产物进行进一步的分析。这一方法和最新克隆和筛查研究已被广泛报道[5，6]。序列分析元基因组方法的基于感兴趣的已知蛋白质，进行预测筛选编码该蛋白质的特异性基因序列。元基因组的研究极大地扩展了微生物资源的利用空间，扩大了人们对环境微生物多样性的认知，目前元基因组技术在医学、生物能源、生态环境保护和农业等领域进行了大规模的探索和研究，也取得了很大的进步。

1 元基因组的产生

1998年Handelman等[2]首次提出元基因组(metagenome)的概念，是指特定环境中全部生物遗传物质总和，决定生物群体的生命现象，又被称为“微生物组”或“人类第二基因组”。元基因组学(Metagenomics)是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。而传统的微生物学和微生物基因组测序和基因组学依靠种植克隆文化早期环境基因测序克隆特定基因(通常用16s rRNA基因)[7]分析微生物多样性丰度。元基因组的研究跨越了微生物研究的初始瓶颈，将很有可能改变人们对微生物世界的传统认识，并在农业、林业、环保、医药等广泛领域都有巨大的应用潜力。

2 元基因组的研究方法

2.1 样品和基因(组)的富集与提取 样品和基因(组) 的富集可以大大提高目的基因的检出概率。目前有两种富集方法，细胞水平富集[8]主要是通过改变底物、营养或物理化学指标对目的微生物进行富集培养。通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释放，并对DNA进行纯化。但是由于富集培养选择性地富集了具有快速生长特性的菌群，因此导致大部分物种多样性信息丢失。另一种基因组水平富集[9]常用的技术为稳定同位素探针技术(SIP)，原理是采用稳定同位素标记底物，其中的“重”原子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中，采用密度梯度离心的方法将“重”的DNA 与“轻” 组分分离，被标记的“重”核酸可以作为 PCR 的模板，用来构建元基因组文库。

2.2 功能筛选 功能筛选法是生物活性水平的筛选，不依赖于任何已知序列信息，仅根据文库克隆子产生的活性物质进行筛选。原理是直接对目的克隆表达的性状在选择培养基上进行筛选，Liu等[10]采用功能筛选策略从蔬菜土壤中克隆和鉴定到了一种新的拟除虫菊酯水解酶Pye3，它具有更宽的底物谱和更强的催化能力，可用于应对拟除虫菊酯造成的环境污染问题。该法筛选能够发现全新的活性物质或全长基因，但工作量大、效率低，生物转化的产物仅在少数情况下具有可见性状酶活性的检测受到研究方法的限制。

2.3 序列分析 因为收集DNA从很大程度上是在不受控制的环境中进行的，最丰富的生物的序列数据是环境样品中最有代表的。实现高覆盖率需要完全解决含量少的基因组也是有必要的，而鸟枪法测序的随机性质保证了这些原本使用传统培养技术而被忽视的生物，它们由一些小片段序列表示。

近年发展起来的高通量基因组测序技术，不需要克隆或PCR便能获取大量的DNA序列信息，相应地不断进步和创新的序列分析技术以及众多生物信息学工具和数据库的出现，也为元基因组数据的分析提供便利。目前，大多数大规模的元基因组研究依赖焦磷酸测序技术，如罗氏的454技术[11]，还有比较常用的ILLUMINA公司MiSeq或HiSeq和Applied Biosystems SOLiD的系统。

3 元基因组的应用前景

元基因组的应用前景非常广泛，在医学、生物燃料、生态环境和农业等各个领域都有巨大的应用价值。接下来，将从这几个方面简要介绍应用的情况。

3.1 医学 微生物群落在保护人体健康中扮演着一个关键角色，但其组成和作用机理仍是未知的。目前，已经对至少250个人体个体的15-18个身体部位的微生物群体进行了元基因组测序。这部分工作作为人体微生物计划的一部分，其最初的目标是确定是否存在核心的人体微生物群，从而来研究与人体健康相关的人体微生物群的关系。另一个医学研究项目是MetaHIT (人类肠道的元基因组)，是由124人来自丹麦和西班牙健康、超重、肠易激疾病患者组成的一个医学研究项目[12]。这项研究试图将肠胃细菌的深度和系统发育多样性进行分类。使用Illumina公司GA序列数据和SOAPdenovo de Bruijn图论工具专门设计用来装配短阅读，研究表明，拟杆菌门和壁厚菌门的构成超过90%的已知的系统分类，控制远端肠道细菌。肠易激综合征患者较未患有肠易激综合征者少了25%的细菌多样性比例，表明肠道生物群落多样性的变化可能与肠道疾病和肥胖有关。现在研究认为，过去一些找不到确切病原菌的肠道疾病，即非感染性肠道疾病(如肠易激综合征等)，肠道内微生物群落结构失调可能与其发生有重大关系。因而在治疗上，就可以选择一些改善肠道菌群失调的微生态制剂。MetaHIT计划的成功完成，将极大地推动了元基因组学的研究，扩大微生物资源的利用可能性。

3.2 生物燃料 生物燃料是来自生物质转化的燃料，如玉米秸秆，柳枝稷，和其他生物质转化成纤维素乙醇，此过程依赖于细菌联合将纤维素转换成糖类，然后糖类再经由发酵变成乙醇。此外微生物也是产生各种生物能源的来源，其中包括甲烷和氢气。工业规模的生殖解构效率需要具有更高生产率和更低成本的酵素[13]，用总体基因体学的方法分析复杂的微生物群落可以有效的筛选适合应用于生物燃料生产工业上的酶，如糖苷水解酶的酶[14]。此外，在了解这些酵素的功能与控制酵素时都会需要有关总体基因体学的知识。元基因组学的方法可以对汇聚性的微生物系统做比较性的统计，如生物气体发酵菌趋同微生物系统[15]、或植食性昆虫如切叶蚁的蚂蚁真菌共生等[16]。

3.3 生态环境 元基因组可以提高监控方法，以控制生态系统的污染物和监控环境污染清理，成功利用微生物净化有毒废物场或受污染水域等[17]。元基因组可以为功能生态环境提供宝贵的见解。元基因组分析发现澳大利亚海狮粪便可能是一个重要的沿海生态系统的养分来源。这是因为细菌同时利用并分解粪便变成可利用的营养物质形式从而进入食物链。

3.4 农业 植物生长的土壤中也存在大量微生物的群落，1克的土壤中包含约109～1010个微生物细胞，其中包括十亿个序列讯息[18]。居住在土壤中的微生物群落是目前科学中已知的最复杂的，而且目前对于其了解并不多，尽管他们在经济上很重要[19]。微生物联合表达了很多种对植物生长必需的生态系方面的服务，包括固定大气中的氮、养分循环、抑制疾病、保存铁和其他金属等等。功能性元基因组学方法被用来探索微生物与植物间的交互作用，通过独立培养这些微生物群落[20]。通过了解未经耕种的、或是很少氮循环的群落菌种与促进植物生长，元基因组学方法可以有助于改善作物和牲畜的疾病检测和增强适应性的耕作方法，并利用微生物和植物之间的关系改善作物的健康。

4 小结

元基因组技术是目前为止最有效的开发和利用未培养微生物资源的有效工具。而我们又正处在一个分子生物学技术飞速发展的年代，各种精细的基因测序技术不断拓展和创新，以及大规模DNA测序平台的广泛使用，有助于人们以低廉的成本完成高覆盖率的基因测序，从而有效开发未知基因组功能。但是目前对于微生物样本采集依旧没有统一的标准，而且来自患者的样本同样存在各种影响因素，另外细菌群落和疾病的关系和作用机制也有急需进一步研究和探索。因此在临床应用上，元基因组技术有待开展更深入的基础研究和探索。

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Advances in metagenomics research

YANG Chun，DENG Shao-ping

四川省科技厅科研基金资助项目(编号：30504010107；30305030273)

R596.3

B

1672-6170(2015)06-0151-03

2015-03-20；

2015-04-12)

△通讯作者，博士生导师