正交试验优化乙醇浸提南瓜总黄酮工艺

李会端 ，崔 旭，游 丹

(楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄675000)

1. 引言

黄酮类物质是存在于自然界中的一大类化合物，属于植物次级代谢产物，是自然界药用植物中主要活性成分之一。天然植物中提取出的黄酮类物质，经研究证实具有消炎、杀菌;降血压、降血脂以及清除活性氧自由基等多种生理药理功能，在食品、医药及化妆品工业有广泛的应用［1-5］。

南瓜富含的人体必需的脂肪酸、氨基酸、生物黄酮、植物甾醇、矿物质、维生素以及多糖等成分，营养价值很高，被公认为特效营养保健食品，具有广阔的食品开发和应用研究前景。国内外学者对南瓜的营养成分和保健作用已有相关研究报道［6-7］，陈少明报道了《南瓜茎中黄酮类化合物提取工艺的优化》，徐海菊报道了《南瓜叶中总黄酮的提取工艺优化研究》，在文献中所确定的最佳提取工艺条件下测得南瓜茎和南瓜叶中总黄酮类化合物的含量分别为3.83 mg·g-1和7.08mg·g-1［8-9］。截至目前尚未发现南瓜果实中总黄酮的提取及提取液对羟自由基清除活性的相关报道。作者选用乙醇浸提南瓜果实黄酮，以芦丁为标准品，通过分光光度法分别测定南瓜皮、南瓜肉和南瓜籽浸提液中的总黄酮含量，并就其提取液对羟自由基的清除能力进行初步探究，分析南瓜果实不同部位黄酮含量的差异，为南瓜营养价值和药用价值的综合开发利用提供实验基础数据参考。

2. 实验方法及流程

2.1 原料:南瓜(采购于楚雄市场)→分离→阴干→粉碎→备用。

2.2 实验方法:黄酮提取液的制备和黄酮类物质的定性实验，芦丁标准曲线的绘制及线性方程的获得，单因素和正交实验优化提取条件及提取液中总黄酮得率的计算，提取液中总黄酮对羟自由基的清除作用具体操作步骤参考文献［4，10］，实验方法及流程如图1 所示。

图1 黄酮提取及自由基清除活性探究实验流程图Fig.1:The experimental illustration of extraction of flavonoids and radical scavenging effection

3. 结果与讨论

3.1 南瓜浸提液黄酮类化合物的显色反应

对南瓜黄酮的提取操作步骤及提取液的制备，总黄酮的显色反应参考文献［4］，显色反应结果如表1 所示，南瓜浸提液与芦丁标准液的显色反应现象一致，说明提取液中含有黄酮类化合物。

表1 总黄酮提取液与芦丁标准溶液的显色反应Tab.1 Chromogenic reaction of flavonoids extracts and rutin solution

3.2 绘制标准曲线得线性方程

芦丁标准溶液的吸收光谱如图2 所示，故确定510nm 为黄酮类物质的最大吸收波长。根据图3 所示的芦丁标准曲线，得线性回归方程A=0.0001 +5.5536C，R2=0.99908。

图2 芦丁标准液和提取液的吸收光谱Fig.2 The absorption spectrum of diagram of rutin and extracts

图3 芦丁溶液标准曲线Fig. 3 The standard curve of rutin solution

3.3 南瓜提取液的单因素实验结果

如图4 所示，南瓜果实总黄酮浸提的较佳料液比为1∶40 (g·mL-1)，分光光度法测得浸提液中总黄酮提取率最高，分别为2.99% (南瓜肉)，1.77% (南瓜皮)和1.13% (南瓜籽)。

浸提温度对南瓜果实提取液中总黄酮得率的影响如图5 所示，低于70℃，黄酮得率随着温度的升高而增加，高于70℃，黄酮得率随着温度的升高而降低，分析原因可能是温度过高导致乙醇挥发损耗和溶出速率问题，故确定南瓜总黄酮提取的较佳浸提温度为70℃，分光光度法测得浸提液中总黄酮得率分别为2.63% (南瓜肉)，1.68% (南瓜皮)和1.13% (南瓜籽)。

图4 料液比对总黄酮提取率的影响Fig. 4 Effection of solid-liquid ratio on the extraction ratio of total flavonoids

图5 浸提温度对总黄酮提取率的影响Fig. 5 Effection of temperature on the extraction ratio of total flavonoids

如图6 所示，南瓜果实总黄酮提取的较佳浸提时间为2.0h，超过2.0h，随浸提时间延长总黄酮得率开始降低。浸提时间2.0h 内，测得浸提液中总黄酮得率最高，分别为3.25% (南瓜肉)，1.97 % (南瓜皮)和1.48 % (南瓜籽)。

提取剂乙醇浓度对提取效果的影响如图7 所示，乙醇浓度为70%时测定南瓜浸提液中总黄酮得率最高，分别为3.05% (南瓜肉)，1.84% (南瓜皮)和1.48% (南瓜籽)。分析原因可能是乙醇浓度为70%更有利于黄酮类化合物从原料中溶出。

图6 浸提时间对总黄酮提取率的影响Fig. 6 Effection of time on the extraction ratio of total flavonoids

图7 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.7 Effection of ethanol concentration on the extraction ratio of total flavonoids

根据单因素实验结果，从乙醇挥发损耗、溶出速率、生产成本和总黄酮得率几个方面考虑，乙醇浸提南瓜总黄酮的最佳工艺条件为:料液比为1∶40 (g·mL-1)、浸提温度和时间分别为70℃、和1.5h，提取剂乙醇浓度为70%，所得浸提液中总黄酮得率最高。

3.4 正交实验结果与分析

在单因素实验基础上，以南瓜子浸提液中总黄酮得率为考察指标，选定料液比、浸提时间、浸提温度和提取剂浓度四个因素，每个因素选定三个水平，设计L9(34)正交实验表(见表2)，正交实验结果见表3。

表2 L9 (34)正交实验因素与水平设计Tab.2 factors and levels of L9 (34)orthogonal experiment

表3 正交实验结果Tab.3 the result of orthogonal experiment

正交实验结果显示，乙醇浸提南瓜籽中总黄酮最优实验条件组合是A3B1C3D3，在此条件下，南瓜籽浸提液中总黄酮得率高达1.80%。四个单因素的主次关系是D ﹥A ﹥B ＞C，即提取剂浓度是最重要的影响单因素，浸提温度因素影响最小。在正交实验确定的最佳提取条件下，即料液比为1.0∶50 g·mL-1，浸提时间为1.5h，浸提温度为80℃，和提取浓度为80%时，分别浸提南瓜皮、南瓜肉和南瓜籽中总黄酮，做三组平行实验，分光光度法测得浸提液中总黄酮的得率分别为2.07% (南瓜皮)，3.25% (南瓜肉)和1.80% (南瓜籽)。从表4 结果来看，南瓜果实不同部位黄酮含量分布差异较大。

表4 南瓜浸提液中总黄酮得率Tab.4 extraction ratio of total flavonoids in pumpkin

4. 结果与讨论

本论文采用乙醇浸提南瓜果实中的总黄酮，设计单因素实验与正交实验，确定了南瓜果实中总黄酮浸提的较佳实验条件为:料液比1.0∶50 (g·mL-1)，浸提温度80℃，浸提时间1.5h，提取剂乙醇浓度为80%，在此条件下，测得南瓜果实不同部位浸提液中总黄酮得率分别为2.07%(南瓜皮)，3.25% (南瓜肉)和1.80% (南瓜籽)。与文献报道的南瓜茎、南瓜叶中总黄酮提取的相关实验数据对比发现，南瓜叶＞南瓜茎＞南瓜籽，可见南瓜果实中黄酮含量较低，结合本实验所得数据，南瓜不同部位黄酮含量分布差异较大，而就南瓜果实而言，黄酮含量也不同，南瓜肉＞南瓜皮＞南瓜籽。

［1］王倩，常丽新，唐红梅. 黄酮类化合物的提取分离及其生物活性研究进展［J］. 河北理工大学学报，2011，33 (01):110—115.

［2］张海悦，张守媛. 响应面优化黑葵花子壳中黄酮的提取及抗氧化性研究［J］. 中国酿造，2011，(09):152—156.

［3］文美琼，李璐，杨申明，等. 彝药野坝子花总黄酮的提取及对活性氧自由基的清除作用［J］. 时珍国医国药，2010，21 (06):1444—1445.

［4］李会端. 碱液冷提法提取程海螺旋藻中的多糖［J］. 江苏农业科学，2014，42 (06):255—257.

［5］李会端. 甜角壳中总黄酮提取及清除羟自由基活性研究［J］. 南方农业学报，2014，45(05):844—849.

［6］宗玉丽，李鑫，付英梅，等. 南瓜籽活性成分研究及应用［J］. 微生物学杂志，2011，31 (02):109—112.

［7］吴国欣，李永星，陈密玉，等. 南瓜子的研究进展［J］. 海峡药学，2003，15 (02):11—13.

［8］陈少明. 南瓜茎中总黄酮类化合物提取工业的优化［J］. 中国医药报道，2007，4(16):127—128.

［9］徐海菊. 南瓜叶中总黄酮的提取工业优化研究［J］. 浙江农业科学，2009， (03):626—628.

［10］李会端. 酶解法提取紫藤总黄酮及自由基清除活性研究［J］. 河南师范大学学报(自然科学版)，2014，42 (03):79—84.