大蒜汁液对鸡源致病菌的抑菌作用研究＊

杨伟平，张海艳，韩建明，牛菁华，王育娜，陈万光

（河南洛阳师范学院生命科学学院，河南洛阳471022）

大蒜是一种可食植物，它不仅富含蛋白质、糖类、多种维生素及矿物质等营养成分，而且还含有至少33种硫化物、多种活性酶类及17种氨基酸，此外还包括一些甾体酯苷和凝集素等，作为药用植物而越来越受到人们关注［1－2］。目前，大蒜已在人类和动物疾病治疗中被证明是一种有效的降血脂药、抗菌剂、降压药、保肝药、杀虫剂，此外大蒜还具有抗肿瘤、降低血清中胆固醇的水平，增加血液凝集等生物学特性［1，3，4］。目前，商品化的包含大蒜粉的胶囊和药片作为食品添加剂已成为国际保健品市场上倍受青睐［5－6］。在动物生产中，大蒜作为一种饲料添加剂添，不仅能够增强动物食欲，促进动物生长，改善肉蛋的品质［7－9］，减少重金属在肝脏的积累［10］，还能刺激免疫系统，控制多种病原体，尤其是细菌、真菌、一些耐酸细菌以及耐抗生素性细菌［3，11］。研究发现，在大蒜中起杀菌、抑菌作用的主要是大蒜素和其它一些有挥发性的硫醚化合物［11－12］，其抑菌能力比其他葱属植物要高的多［1］。因此，大蒜做为一种纯天然的绿色无污染的防腐保鲜剂，在国内外的食品储藏保鲜中一直被广泛研究并应用［13－17］。

本文使用不同浓度的大蒜汁液对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及鸡蛋表面多种杂菌混合物进行抑菌分析，旨在为大蒜作为一种安全防腐保鲜剂能在鸡蛋保鲜中应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

普通紫皮大蒜，无芽，无虫，购于某超市。致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌由西北农林科技大学动物科技学院曹斌云教授的试验室提供。鸡蛋表面的混合菌是用一小块无菌的纱布沾取无菌的生理盐水擦拭储藏1周的鸡蛋表面，然后置于无菌的LB液体培养基中，于37℃，220rpm条件下摇菌培养12h所得。

1.2 致病菌细菌的活化培养

试验前，把在－80℃冻存的大肠杆菌和沙门氏菌、金黄色葡萄球菌在无菌的LB固体培养基上划线活化培养，然后分别挑各菌株的单克隆接种于相应编号的经高压灭菌的LB液体培养基中，37℃，220rpm条件下转接培养2代。活化后的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以0.1%的接种量接种至液体LB培养基中培养12h。取各菌液适量分别于4 000rpm条件下离心15min收集菌体，菌体用无菌PBS液（pH 7.4）洗涤2次，最后用等体积的无菌PBS液重悬菌体。然后通过平板计数法调整各致病菌的浓度至1×108CFU／mL左右。

1.3 不同浓度大蒜汁液的制备

称取一定重量的剥皮的大蒜放入组织匀浆机中制备汁液，然后先用无菌纱布挤压过滤，再用0.45 μm的无菌微孔滤膜过滤，获得一定体积的无菌大蒜原汁液。然后用无菌蒸馏水将大蒜原汁液分别稀释至浓度为75%，50%，25%，10%，5%的稀释液，放置4℃冰箱中保存备用。

1.4 大蒜汁液的抑菌能力－牛津杯法

将灭菌的固体LB固体培养基冷却至60℃左右，准确量取10mL，加入预先水平放置的培养皿内，将无菌的牛津杯放入预先倒入并凝固的LB固体培养基中，分别将浓度为1×108CFU／mL的致病菌以1%接种量加入温度为50℃左右的LB固体培养基中，摇匀，倒板，每个板25mL左右，凝固后去掉牛津杯。然后取不同浓度的大蒜汁液150μL分别加入固体培养基的杯孔中，置于37℃的恒培温养箱中培养12h，测量抑菌圈直径（Inhibitory zone diameter，IZD）。每个处理做3个重复取平均值。

1.5 大蒜汁液最小抑菌浓度及最低杀菌浓度测定

将浓度为10%的大蒜汁液与LB液体培养基按2倍稀释法稀释，配制成大蒜汁浓度为5%，2.5%，1.25%，0.63%，0.31%，0.16%，0.08%的培养液各2mL，然后取浓度为1×108CFU／mL的各致病菌液1mL接种至体积为2mL的含不同大蒜汁浓度的培养基中，摇匀，37℃培养24h后，从以上各试验管中分别吸取0.1mL培养液，涂布于各固体LB培养板中于37℃条件下，培养24h，以平板上细菌落数≤50为大蒜汁液的最小抑菌浓度（MIC）［18－19］，将大蒜汁液浓度高于MIC的各管培养物各吸取0.1 mL涂布于LB固体培养板培养板中，37℃，培养24 h，以菌落数≤5的蒜汁浓度为最低杀菌浓度（MBC）［20］。

1.6 数据统计分析

采用Excel进行数据前处理，用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，多重比较采用Dancan法，结果用“平均值±标准误”。

2 结果与分析

表1 不同浓度大蒜汁液对致病菌的抑菌结果（n＝3）Table 1 Antibacterial effect of the different concentrations of garlic juice on pathogens

2.1 不同浓度大蒜汁液的体外抑菌能力

由表1可以看出，大蒜汁液对各致病抑菌均有一定的抑制作用，抑菌能力随着其浓度的减小而降低。大蒜汁在同一浓度条件下，对各致病菌的抑菌能力依次为：沙门氏菌＞大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞鸡蛋表面混合菌，其中大蒜汁对沙门氏菌、大肠杆菌和鸡蛋表面混合菌的抑菌能力呈差异性显著（P＜0.05）。

2.2 不同浓度的大蒜汁液的MIC和MBC

本试验以LB平板上细菌落数≤50为大蒜汁液的MIC，在MIC的基础上，研究了大蒜汁液的MBC，并以LB平板上细菌落数≤5为大蒜汁液的MBC。由表2和表3试验结果看，大蒜汁液在对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC和MBC均分别为1.25%和2.5%，对金黄色葡萄球菌和鸡蛋表面混合菌的MIC和MBC均分别为5%和7.5%。由此可见，大蒜汁液对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌能力要强于金黄色葡萄球菌和鸡蛋表面的混合菌。

3 讨 论

大蒜是“地里长出来的抗生素”，因能够抑制和杀灭多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，因此有“天然广谱抗生素”之称［21］。研究指出，大蒜对来自粪便的细菌高度敏感，其中对革兰氏阴性菌最为敏感［22］，并且能够特异性的抑制肠道的有害细菌［11］。鸡蛋在储存的过程中，引起鸡蛋腐败变质的微生物主要有大肠杆菌、沙门氏菌、金色葡萄球菌［23］。本试验研究了大蒜汁液对对大肠杆菌、沙门氏菌，金黄色葡萄球菌及鸡蛋表面细菌的抑菌能力。结果表明，不同浓度的大蒜汁液对以上致病菌均有一定抑制作用，其对致病菌的抑菌能力由大到小依次为沙门氏菌＞大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌。在大蒜汁浓度为50%时，其抑菌圈的直径均在28mm以上，试验结果高于I walokun等［21］和苏凤贤［24］的试验结果，但低于陈洪生［25］试验结果。研究还表明，大蒜汁液对致病菌的抑菌强度与抗生素［21］、化学防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾的抑菌效果相当［24］。

表2 大蒜汁液的最小抑菌浓度Table 2 Minimal inhibitory concentration of garlic juice %

表3 大蒜汁液的最小杀菌浓度Table 3 Minimal bactericidal concentration of garlic juice

此外，本试验大蒜汁液对大肠杆菌、沙门氏菌的MIC均为1.25%，对金黄色葡萄球菌和鸡蛋表面混合菌的MIC均为5%。对大肠杆菌的MIC低于I walokun［21］，雷晓燕［26］和陈洪生［25］的试验结果，对沙门氏菌的MIC高于苏凤贤［24］的研究结果，对金黄色葡萄球菌的MIC低于陈洪生［25］和雷晓燕［26］的试验结果，而与I walokun的试验结果相近。对于MBC，大蒜汁对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MBC均低于陈晓月等研究结果［27］，对沙门菌的MBC高于苏凤贤［24］研究结果。由此可见，大蒜汁对各致病菌的抑菌能力，MIC和MBC在不同的研究中均有不同结果，但试验中不同浓度的大蒜汁液对各致病菌表现出的抑制能力多数优于以上研究者的试验结果。这可能是与大蒜的品种、种植的地域以及新鲜程度有关［28－29］，如李晓亮［30］，周延峰［31］，Llamas等［28］均研究表明紫皮大蒜的抑菌和抗菌能力优于白皮大蒜。此外，不同方法获取的大蒜汁，其抑制的微生物种类、抑菌活性差异较大，因在制备过程中会不同程度地改变或损失某些抑菌成分的活性［22］，还有，不同的抑菌试验方法，LB平板的抑菌孔中加大蒜汁液量的多少，以及菌种来源，悬菌液被稀释的浓度、接种量均会影响其抑菌能力［24］。

由以上研究可以看出，大蒜汁液致病菌有强的抑菌和杀菌能力。因此，将大蒜汁液作为生物防腐剂或保鲜剂对鸡蛋保鲜具有可能。在国内，许多研究工作者采用不同药用植物的提取液对鸡蛋进行了保鲜研究。如王婵等［23］在四种植物的乙醇提取液对鸡蛋保鲜效果的比较研究中指出，金银花提取液对鸡蛋的保鲜效果最佳，储藏35d后好蛋率为100%。王劲松等［33］用壳聚糖、蜂胶和金银花的保鲜剂对鸡蛋保鲜，也取得了好的保鲜效果，其中壳聚糖的效果最佳。而在国外，新型的含大蒜油的抗菌塑料包装对即时熟食食品已经起到了一定的保鲜作用［14］。因此，如果我们将大蒜提取液和其他一些具有抑菌作用作用的生物材料做成复保鲜剂对鸡蛋进行涂膜保鲜，也不失为一种很好的保鲜方法。

4 结 论

不同浓度的大蒜汁液对各致病菌均有一定的抑菌能力，其抑菌能力大小依次为沙门氏菌＞大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞鸡蛋表面混合菌。大蒜汁液在对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC和MBC均分别为1.25%和2.5%，对金黄色葡萄球菌和鸡蛋表面混合菌的MIC和MBC均分别为5%和7.5%。因此，将大蒜汁液作为生物防腐剂或保鲜剂对鸡蛋保鲜具有可能。

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