低氧微环境相关因子HIF-1α与癌症的研究

余　平，　刘晓旺，　钟丽菲，　丁维珂，陆凯强，　周志刚，　涂　剑*

(1a.南华大学 药物药理研究所,药物蛋白质组学湖南省高等学校重点实验室;1b.附属第一医院，湖南 衡阳 421001;2.湖南环境生物职业技术学院 医药学院,湖南 衡阳 421001)



低氧微环境相关因子HIF-1α与癌症的研究

余平1a,2，刘晓旺1a，钟丽菲1a，丁维珂1a，陆凯强1a，周志刚1b，涂剑1a*

(1a.南华大学 药物药理研究所,药物蛋白质组学湖南省高等学校重点实验室;1b.附属第一医院，湖南 衡阳 421001;2.湖南环境生物职业技术学院 医药学院,湖南 衡阳 421001)

摘要：环境与癌症的发生密切相关.低氧微环境主要受缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)调控.近年研究表明，低氧微环境HIF-1α可在癌症中高表达，参与癌细胞的生长繁殖、侵袭/迁移、新血管生成和细胞凋亡等过程.研究主要围绕肝癌、乳腺癌和胃癌等与HIF-1α的关系进行讨论.参32.

关键词：低氧微环境；缺氧诱导因子-1α；肝癌；乳腺癌；胃癌

正常机体是由不同组织器官构成的一个不断演进的生态系统.肿瘤细胞将正常生态位改造为适合其生存的低氧和酸性微环境.其中低氧微环境为肿瘤细胞提供了空间和营养物质，使其更适合生存；而肿瘤细胞自身，在性质恶化后转变成癌.缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一种DNA结合蛋白，被发现于低氧诱导Hep3B肝癌细胞株的细胞核提取物中[1].HIF-1是一种异二聚体蛋白结合物，包括HIF-1α和HIF-1β两种亚基.其中，人的HIF-1α基因位于第14号染色体q21~24区，由826个氨基酸组成，主要存在于细胞核，少数位于细胞浆[2].作为一种氧分子感受器，常氧状态下，HIF-1α受泛素-蛋白酶体系的降解而不稳定；缺氧时，HIF-1α降解受抑制，导致其合成后不断积累，使癌细胞不断适应低氧微环境，进而为癌细胞的增殖和癌组织的侵袭/转移等过程提供条件[3].因此，本文将主要围绕几种常见癌症与低氧微环境关键调节因子HIF-1α的关系进行讨论.

1 HIF-1α与肝癌

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，与肝炎病毒(HBV、HCV)的慢性感染或肝硬化的进一步恶化密切关联[4].肝癌细胞增殖周期的4个时期有多种生长因子参与，如细胞周期素D1(cyclinD1)、转化生长因子α(transforming growth factor-α,TGF-α)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)等.在低氧环境下，HIF-1α可以上调这些生长因子，促进肝癌细胞的增殖分化，从而完成细胞周期进程[5].与此同时需要消耗大量的氧和能量，如其周边的氧和能量不足以提供增殖的需求，将引发HIF-1α的大量表达与积聚.而积聚的HIF-1α则可以通过调节糖酵解活性、线粒体功能和自噬作用来为癌细胞提供能量，维持癌细胞的正常增殖和代谢平衡[6].如在肝细胞癌组织中检测到HIF-1α与其下游靶基因葡萄糖转运蛋白Glut1 mRNA 和蛋白表达呈正相关.两者阳性率均与肿瘤大小、临床分期及淋巴结转移情况相关，提示HIF-1α在肝癌的发生发展过程中起着关键作用[7].

肝癌细胞的增殖伴随血管生成，此时主要的调节因子是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF).VEGF可有效的调节血管内皮细胞的分裂、增殖和迁移过程.如遇低氧环境，积聚的HIF-1α将通过调控VEGF等因子的表达影响血管生成.如低氧环境中形成新的毛细血管网，可通过合成NO来上调VEGF及配体的表达参与血管生成启动阶段；通过上调金属蛋白水解酶配合VEGF和血管生成素-2(angiopoietin-2)参与进展阶段；通过上调血小板衍生生长因子B(platelet derived growth factor B)和血管生成素-1来参与塑性改造阶段等[8].在Liu等研究中[9]，利用一种多重激酶抑制剂索拉菲尼来抑制HIF-1α的表达，发现肝癌血管生成明显减少了，此实验验证了HIF-1α与肝癌血管生成的相关性.

血管生成不仅与肝癌细胞增殖关联，而且也是肝癌细胞侵袭/迁移等的必要条件之一.癌细胞侵袭/迁移过程需要满足两个必要条件：一个为新生血管生成，另一个是癌细胞破坏基底膜即细胞外基质(extracellular matrix,ECM).新生血管生成在这一侵袭/迁移过程中，主要起桥梁和供能作用.基底膜的破坏将涉及到基质金属蛋白酶(matrix metallopreteinases,MMPs)的分泌，MMPs是肿瘤侵袭/迁移过程中降解ECM蛋白的重要酶类[10]，ECM由纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原等多种物质组成，控制着细胞形状、分化和迁移等.低氧微环境中，HIF-1α会诱导一系列MMPs分泌，结果极易造成ECM的破坏.HIF-1α再通过调控ECM，使细胞间黏附性减弱，更有利于癌细胞的侵袭/迁移.此外，在张万秋等发现[11]，肝癌细胞的迁移还与Wnt5a蛋白介导的信号通路有关.当低氧HIF-1α表达上调时，Wnt5a蛋白的表达也明显上调，提示HIF-1α诱导Wnt5a 可促进低氧条件下肝癌细胞的迁移.

2 HIF-1α与乳腺癌

乳腺癌的细胞增殖也受新生血管影响.低氧微环境下，HIF-1α表达增加，活性增强，上调VEGF及其受体表达，通过MAPK (Mitogen-activated protein kinase),PI3K/PKB (phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B),PLC (Phospholipase C)等途径促进血管内皮细胞生长[12]，进而加快新生血管生成，为肿瘤的生长和转移等创造条件.另外，王耕等的研究中还提到细胞增殖相关的另一因子——增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA，又称Ki-67)[13-14]，是目前应用最广泛的增殖细胞评估指标之一，能有效反应肿瘤细胞增殖活性.而HIF-1α与PCNA呈正相关，在低氧环境中，HIF-1α能刺激细胞内PCNA表达，进而有效促进癌细胞的增殖.

此外，PHD2也能影响乳腺癌细胞增殖.PHD2是降解HIF-1α的主要酶类，低氧时，PHD2活性降低，导致HIF-1α大量堆积；当HIF-1α积聚到一定程度，又会负反馈地诱导PHD2的表达.PHD2活性增强后可通过影响细胞转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)途径抑制癌细胞增殖[15].TGF-β1是一种细胞自分泌和旁分泌产生的多功能细胞因子，主要作用是刺激细胞增殖、分化和迁移[16].因此，HIF-1α还可通过调控PHD2靶基因间接影响乳腺癌细胞增殖[17].

HIF-1α也能通过调控多种因子如MMPs、LOX和COX-2等的表达来影响乳腺癌细胞的侵袭/迁移.如在乳腺癌MDA-MB-231细胞系中，HIF-1α可上调 MMPs 的表达[18]，作用机制除与肝癌中提及一致之处外，MDA-MB-231乳腺癌细胞中还存在一种赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)的调节.这是于ECM胶原与弹性蛋白聚合起始阶段能稳定ECM的一种关键酶，其表达异常与乳腺癌的侵袭/迁移密切相关.在杨华伟等研究中发现[19]，LOX蛋白在高侵袭潜能的乳腺癌MDA-MB-231细胞中高表达，而在低侵袭性MCF-7细胞中低表达，且LOX的作用可受MMPs和HIF-1α异常表达的调控.

乳腺癌细胞的侵袭/迁移也少不了新生血管生成的影响.之前提及肝癌中已说明，促血管新生的VEGF表达受HIF-1α的调控.其作用于癌细胞迁移的机制大致可概括为以下两点：(1) HIF-1α高表达有助于VEGF的表达，促进新生血管生成，新生血管为癌细胞供氧供能的同时也为其迁移提供通道；(2) HIF-1α表达增加，激活组织蛋白酶D，提高MMPs、尿激酶型纤溶酶激活物受体、纤维连接素、TGF-α和自分泌移动因子等侵袭相关基因的表达，增加对肿瘤细胞基底膜和细胞外基质等的降解，使细胞-细胞、细胞-基质间黏附力降低，侵袭性增加，最终导致细胞的分离和迁移[20].因此，HIF-1α对乳腺癌细胞的侵袭/迁移影响很大，发挥着重要的作用.

3HIF-1α与胃癌

胃癌是我国最常见的一种消化道恶性肿瘤，发病率约占40-50%[21].在胃癌细胞的失控增殖和侵袭/迁移导致的低氧微环境中，HIF-1α仍起主导的调节作用.在胃癌细胞增殖周期中，除激活cyclin 家族来参与调节细胞分裂外，还会刺激HIF-1α大量表达，促使其参与糖酵解途径，为细胞增殖供氧供能.另外，在杨振等对胃癌的研究中[22]，发现HIF-1α在胃癌组织中高表达，会上调VEGF的表达，从而促进癌细胞的增殖和迁移，其作用机制与之前提过的肝癌和乳腺癌相似.

在胃癌的发生发展过程中，还发现了一种调节细胞增殖分化的重要蛋白激酶——丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT).活化的AKT会促使HIF-1α活化及磷酸化,使HIF-1α的稳定性增加,并激活其下游的靶分子,从而导致肿瘤发生.AKT 参与PI3K- AKT/PKB信号通路，协同HIF-1α调节癌细胞的增殖和活性，导致正常细胞恶性转化[23].因此，在胃癌中，HIF-1α可与多种因子共同参与癌细胞的增殖，为癌细胞的侵袭/迁移奠定基础.

近年研究已证实，免疫组化检测的胃癌标本中，HIF-1α在胃癌细胞转移组的表达明显高于未转移组[24-26].高表达的HIF-1α可通过调节MMPs家族，破坏ECM的基底膜，打破阻止癌细胞侵袭/迁移的屏障，促进胃癌细胞迁移.HIF-1α受如半胱氨酸61(cysteinerich61,Cyr61)等蛋白的调控也可影响胃癌细胞的侵袭/迁移.Cyr61可通过核因子κB(nuclear factor of κB,NF-κB)与PI3K/mTOR和MAPK依赖的信号通路增加HIF-1α的合成，进一步可促进胃癌细胞的侵袭/迁移[27].

4HIF-1α与其他癌症

宫颈癌中，低氧能诱导HIF-1α的表达[28]；PI-3K/AKT通路可抑制HIF-1α降解[29].低氧微环境中，HIF-1α还参与了卵巢癌、肺癌和肾透明细胞癌等多种恶性肿瘤的发生发展[30-32].

5展望

随着中国经济的飞速发展，环境与癌症的发生密切相关，影响着肝癌、乳腺癌和胃癌等多种癌症，发病率逐年升高.因此，我们对癌症的防治任重而道远.尽管许多研究已了解到低氧微环境关键调控因子HIF-1α与癌症关系密切，并且知道HIF-1α可能成为癌症诊断和治疗的一个重要的预测指标，但仍需进一步的临床实验予以证实.综上所述，以HIF-1α因子为主的信号通路和以HIF-1α为靶点的癌症预防和治疗的新思路有待进一步发展成熟，真正发挥HIF-1α在癌症中的重大作用，造福人类.

参考文献：

[1] 刘丽璇,吴灵飞,邓巍,等.丹参酮IIA对低氧条件下人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及与HIF-1α、VEGF和野生型P53蛋白表达的关系[J].中国病理生理杂志,2014,30(12) :2155-2160.

LIU Li-xuan,WU Ling-fei,DENG Wei,et al.Effects of tanshinone IIA on proliferation,apoptosis and expression of HIF-1α,VEGF and wild-type P53 in human hepatoma HepG2 cells under hypoxia[J].Chinese journal of pathophysiology,2014,30(12):2155-2160.

[2] Miyazawa M,Yasuda M,Fujita M,et al.Therapeutic strategy targeting the mTOR-IF-alpha-EGF pathway in ovarian clear cell adeno-carcinoma[J].Pathol int,2009,59(1):19-27．

[3] Wong C C,Zhang H,Gilkes D M,et al.Inhibitors of hypoxia inducible factor 1 block breast cancer metastatic niche formation and lung metastasis[J].J mol med (Berl),2012,90(7):803-815.

[4] 张传海,许戈良,荚卫东,等.缺氧诱导因子-1α与上皮型钙黏素在肝癌中的表达及其意义[J].安徽医科大学学报,2011,46( 4):337-341.

ZHANG Chuan-hai,XU Ge-liang,JIA Wei-dong,et al.Expression of HIF-1α and E-cadherin in hepatocellular carcinoma and their clinical significance[J].Acta universitatis medicinalis Anhui,2011,46(4):337-341.

[5] 滕凤猛,吴穷,陈昌杰.缺氧诱导因子-1α调控肝癌细胞对奥沙利铂耐药的机制[J].肿瘤防治研究,2014,41(11):1 176-1 180.

TENG Feng-meng,WU Qiong,CHEN Chang-jie.Mechanism of Hypoxia-inducible Factor-1α Inducing Drug resistance to oxaliplatin in hepatic carcinoma[J].Cancer research on prevention and treatment,2014,41(11):1 176-1 176.

[6] 柳宇,崔毓桂,冒韵东.缺氧诱导因子在细胞能量代谢中的作用[J].医学研究生学报,2014,27(5):542-545.

LIU Yu,CUI Yu-gui,MAO Yun-dong.Hypoxia-inducible factors and their roles in energy metabolism[J].Journal of medical postgraduates,2014,27(5):542-542.

[7] 梁辉，姬宏斌,宫伟,等.肝细胞癌中HIF-1α与Glut1表达的关系及意义[J].实体肿瘤杂志,2014,29(1):28-32.

LIANG Hui,JI Hong-bin,GONG Wei,et al.Study on expression of HIF-1α and Glut1 in tissues of hepatocellular carcinoma and its significance[J].Journal of solid tumors,2014,29(1):28-32.

[8] 李锁严,其木格,刘晓辉,等.缺氧诱导因子(HIF-1α)与肿瘤病理的关系[J].赤峰学院学报,2009,25(2):61-62.

Li Suo-yan,QI Mu-ge,LIU Xiao-hui,et al.Hypoxia inducing factor (HIF-1 alpha) relation with tumor pathological[J].Journal of Chifeng university,2009,25(2):61-62.

[9] Liu L P,Ho R L,Chen G G,et al.Sorafenib inhibits hypoxia-inducible factor-1α synthesis:implications for antiangiogenic activity in hepatocellular carcinoma[J]. Clin cancer res.2012,18:5 662-5 671.

[10] Erdozain O J,Pegrum S,Winrow V R,et al.Hypoxia in abdominal aortic aneurysm supports a role for HIF-1α and Ets-1 as drivers of matrix metalloproteinase up regulation in human aortic smooth muscle cells[J].J vasc res.2011,48:163-170.

[11] 张万秋，朱一超.缺氧对人肝癌细胞 MHCC-97L 迁移的影响[J].南京医科大学学报,2012,32(11):1 522-1 526.

ZHANG Wan-qiu,ZHU Yi-chao.Hypoxia induces the migration of MHCC-97L hepatic carcinoma cells[J].Acta universitatis medicinalis Nanjing,2012,32(11):1 522-1 522.

[12] Fu Y J,Luo H Q.The effect of (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on the expression of HIF-1α and VEGF in breast cancer MCF-7 cells[J].J chi on col.2012,18(6):402-404.

[13] 郝朗松,王耕,钱昆,等.乳腺癌组织中缺氧诱导因子-1α的表达及其与肿瘤细胞增殖、血管形成的关系[J].四川大学学报,2007,38(1):60-63.

HAO Lang-song,Wang Geng,QIAN Kun,et al.HIF-1α expression and relationship involving tumor cell proliferation and angiogenesis in Human breast carcinoma[J].Journal of sichuan university,2007,38(1):60-63.

[14] 柏璐，俸瑞发,刘晓萌,等.HIF-1α对乳腺癌细胞增殖及血管生成影响的探讨[J].中华肿瘤防治杂志,2013,20(15):1 158-1 161.

BO Lu,FENG Rui-fa,LIU Xiao-meng,et al.Influence of HIF-1α in cell proliferation and giogenesis of breast cancer[J],Chinese journal of cancer prevention and treatment,2013,20(15):1 158-1 161.

[15] Wottawa M,Leisering P,Ahlen Mv.Knockdown of prolyl-4-hydroxylase domain 2 inhibits tumor growth of human breast cancer MDA-MB-231 cells by affecting TGF-β1 processing[J].Int j cancer.2013;132 (12):2 787-2 798.

[16] Yamasaki S,Taguchi Y,Shimamoto A,et al.Generation of Human induced pluripotent stem (ips) cells in serum- and feeder-free defined culture and TGF-Beta1 regulation of pluripotency[J].Plos one.2014,9(1):e87151.

[17] 林巧妹，尉建锋,王伟林,等.肝细胞癌中HIF-1α与PHD2的表达及临床意义[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2013,22(6):533-538.

LIN Qiao-mei,WEI Jian-feng,WANG Wei-lin,et al.expression and clinical significance of HIF- 1 alpha and PHD2 in hepatocellular carcinoma[J].Chinese journal of histochemistry and cytochemistry,2013,22(6):533-538.

[18] 姜丽丽,师永红,肖瑞,等.乳腺癌细胞中HIF-1α对MMP1、8、15、16、17的调节作用[J].临床与实验病理学杂志,2012,28(11):1 188-1 190.

JIANG Li-li,SHI Yong-hong,XIAO Rui,et al.The regulation of matrix metalloproteinase 1， 8， 15， 16， and 17 by HIF- 1 in human breast cancer cell line[J].Journal of clinical and experimental pathology,2012,28 (11) :1 188-1 190.

[19] 杨华伟,刘剑仑,李景涛,等.赖氨酰氧化酶与乳腺癌侵袭转移相关因子的研究[J].重庆医学,2013,42(17):1 976-1 979.

YANG Hua-wei,LIU jian-lun,Li Jing-tao,et al.The relationship between breast invasion and metastasis related factors and lysyoxidase[J].Journal of chongqing medical,2013,42 (17) :1 976-1 979.

[20] 马兆生,周士福,金琳芳,等.HIF-1α和Glut-1在乳腺癌中的表达及其与血管生成的关系[J].肿瘤防治研究,2008,35(8):569-571.

MA Zhao-sheng,ZHOU Shi-fu,JIN Lin-fang,et al.Alpha HIF - 1α and Glut-1 expression in breast cancer and its relationship with angiogenesis [J].Cancer prevention research,2008,35 (8) :569-571

[21] Birner P,Schindl M,Obermair A,et al.Overexpression of hypoxia-inducible factor 1α is a marker for an unfavorable prognosis in early-stage invasive cervical cancer [J].Cancer research,2000,60(17):4 693-4 696.

[22] 李国元,赵久达,王成,等.HIF-1α和VEGF在胃癌中的表达及临床意义[J].中国癌症杂志,2010,20(8):602-606.

LI Guo-yuan,ZHAO Jiu-da,WANG Cheng,et al.Expressions of HIF-1α,VEGF in gastric carcinoma and their clinical significances[J].China oncology,2010,20(8):602-606.

[23] 顾晓萌,卢雪峰,王慧,等.pAKT、HIF- 1α在胃癌中的表达及与血管生成的关系[J].中国现代普通外科进展,2007,10(3):219-223.

GU Xiao-meng,LU Xue-feng,WANG hui,et al.Relationship between pAKT,HIF- 1 α expression and angiogenesis in gastric cancer [J].Chinese journal of current advances in general surgery,2007,(3):219-223.

[24] 曹洪涛.胃癌组织中HIF-1α、Bax和Bcl-2蛋白的表达及其与肿瘤浸润转移的相关性[J].临床和实验医学杂志,2014,13(8):631-633.

CAO Hong-tao.The relationship between the expression of hypoxia inducible factor-1α ( HIF-1α ) ，Bax and Bcl-2 in gastric tisse and tumor invasion[J].Journal of clinical and experimental medicine,2014,13 (8) :631-633.

[25] 孙旭东,欧希龙,关云艳,等.HIF-1α与VEGF165在胃癌的表达及其意义[J].江苏医药,2011,37(11):1 288-1 290.

SUN Xu-dong,OU Xi-long,GUAN Yun-yan,et al.Expressions and significance of HIF-1α and VEGF165 in gastric carcinoma[J].Jiangsu medical journal,2011,37(11):1 288-1 288.

[26] 贾淑薇,董蕾,贾辉,等.HIF-1α和 VEGF-c在胃癌组织中的表达及临床意义研究[J].现代医学进展,2013,32(13):6 351-6 354.

JIA Shu-wei,DONG Lei,JIA Hui,et al.Research the expression of HIF-1α VEGF-c and the clinical significance in gastric carcinoma [J].Progress in modern biomedicine,2013,32(13):6 351-6 351.

[27] 武新华,亓玉芹.Cyr61和HIF-1α在胃癌中的表达及临床意义[J].胃肠病学和肝病学杂志,2011,20(5):411-413.

WU Xin-hua,Qi Yu-qin.Expression and clinical significance of Cyr61 and HIF-1α in gastric cancer [J].Chinese journal of gastroenterology and hepatology,2011,20(5):411-413.

[28] Mayer A,Hockel M,Vaupel P.Endogenous hypoxia markers in locally advanced cancers of the uterine cervix:realty or wishful thinking[J].Strahlenther onkol,2006,182(9):501．

[29] Minet E,Michel G,Mottet D,et al.Transduction pathways involved in hypoxia -inducible factor-l phosphorhlation and activation[J].Free radic biot,2001,3l (7):847.

[30] Wang Y,Ma J,Shen H,et al.Reactive oxygen species promote ovarian cancer progression via the HIF-1α/LOX/E-cadherin pathway[J].Oncol rep,2014,32(5):2 150-2 158.

[31] Hsia T C,Liu W H,Qiu W W,et al.Maslinic acid induces mitochondrial apoptosis and suppresses HIF-1α expression in A549 lung cancer cells under normoxic and hypoxic conditions[J].Molecules,2014,19(12):19 892-19 906.

[32] Minardi D,Lucarini G,Santoni M,et al.Survival in patients with clear cell renal cell carcinoma is predicted by HIF-1α expression[J].Anticancer res,2015,35(1):433-438.

Biography：YU Ping, Male,born in 1978,Intermediate Technician,research diection for molecular pharmacology.

Study on Related Factor HIF-1α in Hypoxic Microenvironment and Cancer

YU Ping1a,2,LIU Xiao-wang1a,ZHONG Li-fei1a,DING Wei-ke1a,

LU Kai-qiang1a,ZHOU Zhi-gang1b,TU Jian1a*

(1a.Institute of Pharmacy and Pharmacology,Learning Key Laboratory for Pharmacoproteomics;1b.The First Affiliated Hospital,University

of South China,Hengyang 421001,China;2.Medical College,Hunan Polytechnic of Environment and Biology,Hengyang 421001,China)

Abstract：The environment is closely related with the occurrence of cancer.Hypoxic microenvironment is mainly regulated by Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α).In recent years,studies have shown that in hypoxia environment,HIF-1α could be abundantly expressed in many kinds of cancer,involved with the growth,invasion/migration,angiogenesis and apoptosis process of cancer cells.This article is mainly discussed around the relationship between HIF - 1α and cancer such as liver cancer,breast cancer and gastric cancer.32refs.

Keywords：Hypoxic microenvironment,Hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α),liver cancer,breast cancer,gastric cancer.

中图分类号：R73-3

文献标识码：A

文章编号：2095-7300(2015)02-052-05

通讯作者*,E-mail:tujian0734@aliyun.com.

作者简介：余平(1978-)，男，湖南衡阳人，硕士研究生，实验师，研究方向：分子药理.

基金项目：湖南省自然科学基金青年项目(编号：2015JJ3101)；衡阳市科技局课题(编号：2013KJ22)

收稿日期：2015-05-13