巴斯德开启预防医学的大门——纪念路易斯·巴斯德发明狂犬病疫苗130周年

杨正时，房 海

(1 中国食品药品检定研究院，北京，100050；2 河北省预防兽医学重点实验室；3 河北科技师范学院)



巴斯德开启预防医学的大门
——纪念路易斯·巴斯德发明狂犬病疫苗130周年

杨正时1,2，房 海2,3

(1 中国食品药品检定研究院，北京，100050；2 河北省预防兽医学重点实验室；3 河北科技师范学院)

路易斯·巴斯德(Louis Pasteur,1822-12-27～1895-09-28)是法国伟大的科学家，他发明了狂犬病疫苗，并于1885年7月6日，首次给被狂犬严重咬伤的9岁男童约瑟夫·迈斯特(Joseph Meister，1876-02-21～1940-06-24)治疗并获得成功。从此，人们普遍将巴斯德使用狂犬病疫苗首次对人进行接种的这一日期(7月6日)，作为了人类历史上用人工制备疫苗来征服传染病的时代起点。到2015年7月6日，历史的车轮已经走过了漫长的130年。纵观巴斯德的科学生涯，可以大致划分为3个阶段：①1856年前的化学年代；②以1856年研究发酵开始接触到了微生物为起点，进入生命科学年代；③以1865年研究蚕病为起步标志，进入医学(包括兽医学)年代。巴斯德在化学、生命科学、医学乃至农业领域都有独到的发现与研究，然而使他留芳千古的是病原学说的创立和免疫预防接种的发明。在发明疫苗的探索中，巴斯德找到了开启疫苗大门的钥匙——控制病原体的毒力。他发现了使鸡霍乱病原细菌——多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)自然减毒的途径，更可贵的是使炭疽芽孢杆菌发生人为的毒力变异，并成功发明了鸡霍乱疫苗、炭疽减毒疫苗。在对狂犬病疫苗研究中通过采用兔脑传代的方法，建立了由街毒向固定毒演变的狂犬病病毒固定毒经典理论，并成功研制出了安全有效的狂犬病疫苗，同时建立了对狂犬病的巴斯德预防治疗法。狂犬病疫苗百年来虽不断地推陈出新，但巴斯德创造的原理仍为经典的指导原则。

路易斯·巴斯德；狂犬病疫苗；预防兽医学

狂犬病是人类有史以来病死率最高，也还未能找到有效治疗方法的传染病。同时，狂犬病又是完全能预防，也最能体现“预防为主”精神的疾病。狂犬病疫苗是特效预防狂犬病的唯一生物制剂，其发明人是法国科学家路易斯·巴斯德(Louis Pasteur,1822-12-27～1895-09-28)。2015年7月6日，是巴斯德发明狂犬病疫苗发明130周年[1，2]。

巴斯德(图1，源自：http://image.baidu.com)，1822年12月27日出生于法国东部汝拉省的多尔城。1843～1848年，在巴黎高等师范学院学习化学，1847年获化学科学博士学位，1848年在酒石酸盐的晶体研究中发现同分异构体而获得了英国皇家学会颁发的朗福德奖章(Rumford medal)。1849～1854年，在斯特拉斯堡大学教授化学。1854～1857年，任里尔大学理科系主任，开始研究甜美的发酵，提出细菌发酵理论。1862年当选为法国科学院院士。1864年，开设自然生发讲座，发明了挽救酿酒工业的巴斯德杀菌法。1865年，研究蚕病，发现蚕软腐病和蚕孢子虫病的起因与采用隔离消毒的预防措施，挽救了法国，欧洲的丝绸工业，1870年出版《蚕病学》。1871年，开始研究啤酒发酵。1877年开始研究炭疽热，并与1881年在普宜公开展示炭疽疫苗预防接种效果。1880年研制出鸡霍乱疫苗，并开始研究狂犬病。1885年7月6日，首次对被狂犬严重咬伤的9岁男童约瑟夫·迈斯特(Joseph Meister，1876-02-21～1940-06-24；图2，源自：http://en.wikipedia.org)，进行了狂犬病疫苗接种并获得成功，也因此轰动了世界，成为开启现代疫苗时代的标志性起始点。1888年创立了世界上最有名望的生物研究中心之一的巴斯德研究所(图3)，并任研究所第一任所长直至1895年。1895年9月28日，这位为征服细菌，造福人类而奋斗终生的科学家溘然长逝于巴黎近郊的圣克劳德，享年72岁，法国为他举行国葬。

巴斯德是法国著名化学家、微生物学的奠基人、近代疫苗之父，“不要在已成事业上逗留”是他的座右铭。他在化学、医学、乃至农业领域都有独到的发现与研究，然而使他流芳千古的是病原学说的创建和免疫预防接种的发明。他的贡献使全人类在过去、现在与将来免受病痛，减少死亡而永久受益[3]。

图1 路易斯·巴斯德 图2 约瑟夫·迈斯特 图3 巴斯德研究所

1 巴斯德科学生涯的3个年代

巴斯德的科学研究生涯基本可以划分为3个年代——化学科学年代、生命科学年代、医学(包括兽医学)科学年代。

1.1 化学科学年代

从1843年进入大学，学习化学，毕业后获化学博士学位，并在大学任教，讲授化学，从事晶体的研究。因发现外消旋酸的立体异构体，年轻的巴斯德获得了英国皇家学会颁发的朗德福奖章，在世界化学界崭露头角。因此在1856年(34岁)前，巴斯德全身心地投入化学事业，是一位“纯粹”的化学家。

1.2 生命科学年代

巴斯德任里尔大学化学系主任期间，于1856年开始研究发酵——一个在酿酒、食品工业中最普遍存在的问题，开始遇到了微生物，涉及到了有生命物质的研究，迈进了生命科学年代。发酵问题的研究前后持续了20年。其间，经历了生命的起源等许多严肃而关键的讨论与争辩。1860年，巴斯德著名的曲颈瓶实验决定性地否定了微生物自然发生学说。至今仍在食品工业上广泛应用的巴斯德杀菌法也是这个时期的重要成果。

1.3 医学(包括兽医学)科学年代

进入医学(包括兽医学)年代显然是进入生命科学年代中最重要组成部分，突出表现了巴斯德的研究与人类生命、疾病更为密切的关系及作出的贡献。这一阶段以蚕病的研究为标志，也构成了现代传染病学的开篇经典。

自从中国的养蚕和丝织技术传到欧洲后，在法国的南部形成了一个养蚕中心。但有一种蚕瘟在法国蔓延，蚕身上长满黑色的斑点，病蚕成批死亡。法国的蚕丝业遭到严重损失，蚕农们请求政府派专家来救治。1865年，法国农业部组建了一个委员会来专门研究这种蚕病。权威人士杜马教授提议巴斯德出任该委员会的负责人。杜马教授知道，巴斯德并非是这方面的专家，但他深深地了解他的学生巴斯德，他的人品，他的勤奋，他的学识，他的才能，相信只有巴斯德才能担当解决蚕病的重任。虽然巴斯德知道自己对蚕病一无所知，甚至连一条蚕都没有见过，出于对杜马老师的尊敬和对蚕农的同情，巴斯德毅然把这件事应允下来。他只身来到蚕病重灾区阿莱斯(Alais)实地调查，走访养蚕场，与蚕农交谈，边学习养蚕知识、阅读关于桑蚕的书，边查找蚕病的原因。对蚕病的病程有了一个大概的了解。有的蚕第一龄就在蚕架上病死，有的则在第二龄死亡，有的经历第3，第4次脱皮后爬上桑条做茧，蛹变成了蛾，但蛾有病，触角畸形，腿脚萎缩，翅膀像烧焦似的，这些蛾产的卵，第二年孵化不出健康的蚁蚕。

巴斯德把一间小房改装成一个简陋的实验室。他找来各龄期的蚕，放在显微镜下仔细观察，发现多数蚕身上有胡椒样的黑点，虽然没有明显的病态，但也属于病蚕，因为它们吃桑叶时没有那种“雨打芭蕉”似的沙沙声。巴斯德进一步把病蚕加水研磨成糊状，取一滴放在玻璃片上置显微镜下观察，发现有许多椭圆形的棕色微粒，而这种微粒在健康蚕体内是找不到的。经过几百次的观察，巴斯德最后肯定这些椭圆形的微粒就是引起蚕病的病原体。由于这种棕黑斑点像病蚕粘了一身胡椒粉，于是把这种蚕病也通俗地称为“胡椒病”。

“胡椒病”是一种瘟疫，当地蚕农也称它为蚕瘟。为了证明“胡椒病”的传染性，巴斯德在桑叶上刷上这种致病的微粒，或将桑叶在有病蚕微粒的溶液里浸泡，然后给健康的蚕吃，结果没有病的蚕也会出现病态，先是不爱动，不爱吃，然后在身上起小黑点，直至腐烂。巴斯德观察到蚕架上的蚕，一旦上面格子的蚕染病，下面一格的蚕很快也会生病，这可能是由于染病的蚕粪掉下去致使下格的蚕发病。为此，巴斯德把病蚕的粪便一粒一粒地捡出来，放在无病的蚕中间，结果发现这些无病的蚕也很快出现上述的症状。因此，巴斯德认定防止蚕病蔓延的第一要著是：切断传染源，把病蚕隔离出来。巴斯德推断棕色微粒的病原在病蚕成蛹至蛾的变态过程中也会把病原带入到雌蛾体内，巴斯德也将雌蛾加水研磨成糊状后在显微镜下检查，若发现有这种微粒，就将雌蛾与其所产的卵一起烧毁；若完全没有这种微粒，则将其所产的卵留下来，作为来年的蚕种。由于采取了对病蚕的隔离销毁，以及简单而严格的检种措施，保证了健康蚕种的生长与繁殖。经过3年(3个盛夏)不分昼夜的工作，巴斯德终于在1868年扑灭了在法国已流行了10余年的蚕瘟，挽救了毁灭边缘的法国养蚕业和蚕丝业。1870年，巴斯德将蚕病的研究成果写成“蚕病学”一书出版，作为数年来防治蚕病的总结。

巴斯德当年研究的这种蚕病，即现在已知的蚕微粒子病(Pébrine)。该病在国外记载的第一次流行是1845年发生于法国，后来传遍意大利、西班牙、叙利亚及罗马尼亚，1865年使法国及意大利的蚕业陷于绝境。该病的病原为原生动物(Protozona)——微孢子虫属(Nosema)的家蚕微孢子虫(Nosemabombycis)，其生活周期中有孢子、芽体、裂殖子、孢子芽母细胞等不同发育阶段。孢子卵圆形，大小为(2.0～2.3)μm×(3.6～3.8)μm，巴斯德当年在显微镜下所见到的微粒即孢子。

传染病是由病原微生物所引起并能传播给他人(其它个体)的疾病，古代中外医家都曾以不同的名称记载过传染病。至于确知传染病是由于致病性微生物侵入人体所引起的疾病，则系在17世纪荷兰生物学家、显微镜学家安东尼·范·列文虎克(Antony van Leeuwenhoek，1632-10-24～1723-08-26)发明显微镜、并在1676年最先发现了细菌之后的事[4]。19世纪下半叶，在巴斯德、德国医生和细菌学家罗伯特·科赫(Robert Koch，1843-12-11～1910-05-27)的引领下，一些重要传染病的病原体在这一时期相继被发现、确认和分离出来。虽然也在这一相仿时期，甚或稍早一些，有一些科学家在防控医院感染，在对传染病防控中的某些环节作出过重要贡献，但仅仅巴斯德，在1865年首次确定一个传染病的病原体，确定传染源，传播途径，并提出了严密彻底的防控措施，扑灭了在法国已蔓延数年之久的蚕瘟——家蚕粒子病。虽然这是对一种蚕病的防控，但防控其他兽医传染病、人的传染病，其原创、其方法都是适用的，可予借鉴的。这些传染病防控原则，直到今天仍然使用。巴斯德像在其他方面丰功伟绩一样，同样也是传染病学的第一人。对蚕病的研究，成为了现代传染病学的开篇经典与样板。

2 巴斯德找到了开启疫苗大门的钥匙——控制病原体毒力

巴斯德对鸡霍乱疫苗、炭疽疫苗的研制成功，都是通过控制(减弱并稳定)相应毒力的途径，可以说是找到了开启疫苗大门的钥匙。

2.1 鸡霍乱疫苗：偶然发现自然减毒

1878年，巴斯德开始研究鸡霍乱。鸡霍乱是由多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)引起的一种急性腐败性传染病。19世纪后期这种禽病在法国严重流行。巴斯德当时正进行鸡霍乱病理学的研究。1880年夏天，他分离得到多杀巴斯德氏菌纯培养物。他把这种培养菌注射健康鸡，成功地诱发了鸡霍乱，从而明确了多杀巴斯德氏菌的病原性意义。

由于每天在肉汤中接种传代，实验室的工作台上排满了弃置的培养物。瓶子里的鸡霍乱培养物应该还是活的，不过有些已经过了几周。巴斯德准备清理一下，并交代助手将这几滴陈旧的培养物给几只鸡注射一下(这一指令太重要了！巴斯德突然想到了什么？为什么要求助手将本想废弃的细菌液给鸡注射？)。鸡在被注射后立即患病，失去了那种惯常的活跃。第二天却发现注射的鸡没有死。巴斯德感到疑惑。因为以前的培养体微生物，是使20只鸡死20只。他把这些康复得奇怪的鸡交给管家之后与助手们出外度假。暑假过后，巴斯德需要健康的鸡做试验。由于放假前临时额外地用去了几只做陈旧培养液试验的鸡，没有及时补充准备新鸡，巴斯德就把放假前剩下的新鸡全部用上，把曾注射了陈旧培养体染上鸡霍乱但康复的几只鸡也进行接种。助手们将新鲜的鸡霍乱微生物的肉汤培养液注射到从未使用过的新鸡，也注射到复了原的鸡。次日，注射的新鸡都死了，它们原应死的；而用陈旧培养体注射之后复了原的几只鸡，打了同样致命的剂量，它们完全抵抗住了这个剂量的注射(攻击)，没有死，也没有得病[5]。巴斯德看到这个情境，顿时领悟到其中的缘由，解开了他在放假前见到注射陈旧培养体后的鸡为什么不死的疑惑：搁置时间长久的培养体，在瓶子里老起来，微生物老了，就温驯了，他们给鸡染上这病，但只染上了一点儿病，略微的一点儿病，刚好使它们能够复原，它一旦恢复，就能抵抗致命剂量新鲜培养体的注射。这就是巴斯德不同于常人的智慧。一个人，或许也能够做出同样意外的实验，但可能要花费几年的时间才能对自己说明其奥秘，了解其内涵与意义。而巴斯德，从几只无意中得到保护的鸡身上，马上看见一种防疫物以抵抗毒性微生物的新方法。他见到了胜利的曙光，因为在巴斯德的脑海里充满着事业成功的希望。

巴斯德开始了正式的试验。他把新鲜菌液分别注射到两组鸡身上：一组是以前注射过陈旧菌液而没有死的那些鸡；一组是从来没有注射过任何菌液的，没有生过病的鸡。结果发现，那些没有注射过任何菌液的鸡很快呈现出鸡瘟的全部症状而死亡；而那些注射过陈旧菌液的鸡都安然无恙，它们仍旧吃食，仍旧追逐嬉戏，只有个别的有些精神不振，但根本不是病态，过两天这症状就消失了。巴斯德连续做了5次这样的实验，结果都是一样。注射过陈旧菌液的鸡再接受到新鲜菌液的注射根本不会死亡，它们对鸡瘟似乎已经适应，已有很强的抵抗力。

菌液搁置时间久了，毒性就会减弱，巴斯德以化学家特有的敏感，认为是由于空气中氧气的作用。于是他依次把放置几天的、1个月的、2个月和3个月的菌液分别注射到健康的鸡后，鸡的死亡率分别是100%，80%，50%和10%。如果注射更久以前的菌液，则鸡自然也得病，却不会死亡。如果再给这些鸡注射毒力很大且足以使它们致死的鸡瘟菌液时，它具有了抵抗这种疫苗的能力，也可以说鸡瘟对这些鸡已没有影响。因此，预防鸡霍乱的办法找到了，巴斯德成功地发明了鸡霍乱疫苗。

巴斯德发现的自然减毒的毒力变异理论与方法至今仍然有用，长时间在人工培养基上传代保存能使某些细菌的毒力减弱，也成为现在用于诱导细菌毒力减弱的一种重要方法。最早成功的经典例子就是用于免疫预防结核病的卡介苗(Bacillus Calmette Guérin，BCG)，以其制备活疫苗，即卡介苗。在巴斯德禽霍乱疫苗成功50年后的1907～1920年间，同样是在巴斯德研究所的法国细菌学家阿尔贝·莱昂·夏尔·卡尔梅特(Albert Léon Charles Calmette，1863-07-12～1933-10-29)和卡米耶·介朗(Camille Guérin，1872-12-22～1961-04-09)，将法国兽医学家、生物学家埃德蒙·伊西多尔·艾蒂安·诺卡尔(Edmond Isidore Étienne Nocard，1850-01-29～1903-08-02)于1901年从患结核性乳腺炎的奶牛分离到的牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)在胆汁体积分数为0.05的甘油马铃薯培养基上，使其生长繁殖，并隔2～3周传代1次，发现在此培养基上连续传代能够使其毒力逐渐降低。历时13年经过230余代，经动物试验，牛分枝杆菌完全失去了致病力，从而产生对结核的免疫力。

巴斯德在鸡霍乱疫苗上的成功多少有一点偶然性，但类似的偶然事件在生物学研究领域中并不少见，20世纪80年代初，澳大利亚医生Barry J Marshall在假期后发现幽门螺杆菌(HelicobacterPylori,HP)生长，与病理学教授J Robin Warren共同获得2005年诺贝尔医学奖[6]。请铭记巴斯德的名言：机遇只偏爱有准备的人！

2.2 炭疽疫苗的成功：人为减毒变异

由炭疽芽孢杆菌引起的牛和羊的炭疽在19世纪的欧洲是一种常见流行的严重传染病。德国细菌学家科赫在1876年已宣布检验出炭疽的病原菌为炭疽芽孢杆菌，巴斯德用显微镜证实了科赫的发现，还同时发现炭疽芽孢杆菌具有耐热性芽孢，对外界环境有极强的抵抗力，能造成环境持续而广泛的污染。在土壤中能够长期存活，在干燥的土壤中能存活60年以上。1990年7月，我国湖南省发生一起因挖树根暴露了1926年埋葬的死于炭疽的人的尸体，从而感染炭疽，其间隔长达64年。1970年，在某一国家公园，考古学家在考古时挖掘出一些骨骸，根据碳原子测定，约有200年±50年之久，该骨骼经培养后分离出炭疽杆菌。Jacotot H 和Virat B于1954年发现，由巴斯德在1886年制备的炭疽芽孢在68年后仍具有活性[7]。患病的牧群踩过的土壤使健康的家畜发病，牧人把感染炭疽病死的羊埋在地下，经蚯蚓或是其它昆虫把杆菌带到表土，沾染到草叶上。巴斯德发现，羊在这些地方吃草，被芒刺植物扎伤一点点，细菌就会通过这些微伤进入羊的体内，使羊很快感染上了炭疽病而死亡。

1881年，巴斯德在研究炭疽疫苗时，继续沿用鸡霍乱疫苗的原理与方法，即用培养时间较长的炭疽芽孢杆菌的老培养物，对牛、羊做预防接种，但没有成功。后来发现这种处理方法不能使炭疽芽孢杆菌的毒力减弱。现在知道，这个方法应该也是有效的，不过陈旧培养物需要搁置更长的时间。在1907年用芽孢大剂量接种北美松鼠后贮藏于实验柜内，22年后变为无毒。巴斯德后来采用了新的减低毒力的方法，既提高培养温度来培养炭疽芽孢杆菌，结果成功了。在防病实践中人们知道，禽类不受炭疽芽孢杆菌的自然感染，而且巴斯德证明在正常情况下，禽类对实验性感染也是有抵抗力的。他认为家禽对炭疽的抵抗力可能是由于禽类的体温高的缘故。于是他将鸡人工降温，将鸡放在一只四周用冰围着的桶中，使鸡的体温接近或等于牲畜的体温，再注射炭疽杆菌于鸡体内，发现这样经降温的鸡容易感染，并因典型败血症濒于死亡。巴斯德喜出望外，他马上抓住炭疽杆菌的作用温度有关这一关键进行研究。他发现在42～43 ℃培养的炭疽芽孢杆菌失去了产生荚膜的能力，毒力也降低了，研制出了弱毒炭疽杆菌疫苗[8]。为了证实炭疽疫苗的预防接种效果，1881年6月4日在巴黎近郊的普宜(Pouilly le fort)农场(后改名为巴斯德庄园)进行了著名的现场示范实验。共用60头羊，其中10头作为对照，25头预防接种2次(间隔2周)，另25头不做预防接种，几周后再用强毒力的炭疽芽胞杆菌分别感染上述两群各25头羊，结果未做预防接种的25头羊全部死亡，做了预防接种的25头均存活无恙。这一示范实验肯定地证明了弱毒炭疽疫苗的接种对炭疽的预防作用。采用这种方法使一度给牛、羊带来毁灭灾难的炭疽病几乎完全被控制。巴斯德培养的炭疽芽孢杆菌苗(巴氏Ⅱ号炭疽芽孢苗)至今仍在使用。

3 狂犬病疫苗的成功：开启了一个疫苗时代

巴斯德对狂犬病疫苗的研究成功，也是通过控制(减弱并稳定)相应毒力的途径，但自此可以说是开启了一个疫苗时代。

3.1 狂犬病毒在哪里

巴斯德在成功了鸡霍乱疫苗、炭疽疫苗之后，于1882年开始进行预防狂犬病的研究。现在已知，狂犬病是由狂犬咬人时狂犬病毒(Rabies virus)随唾液进入被咬机体引起的，但在巴斯德开始研究狂犬病时，病毒尚未被发现。病原是什么，它在哪里，一切都不知道，一切从零开始。巴斯德明白要研制出像鸡霍乱、炭疽病的减毒疫苗的首要条件是分离到病原体。因此，巴斯德的第一步是要找到狂犬病原体。

巴斯德首先选择了从狂犬的唾液中寻找。既然狂犬咬人时，能将人感染，那么狂犬的唾液中必定存在有狂犬病原体。要想以狂犬为对象进行实验，其困难是可想而知的。狂犬每天狂吠不止，时刻危胁着每一个靠近它的人。为了摄取它的唾液，巴斯德的助手们先用绳子套住疯狗的头，然后抓住它的四条腿强行提出笼来，硬是把它按到实验桌上，掰开了满是唾沫的嘴巴。巴斯德手里拿着管子，将管子的一头送进狂怒的疯狗的嘴巴，另一头则含在自己的嘴里，用力吸气，以便将疯狗的唾液尽可能多的吸进管子里。此时，巴斯德的胡子几乎凑近到离狗头只有几英寸的地方了[9]。巴斯德和他的助手们早已把自己可能遭到的危险完全置之度外了。

巴斯德将疯狗的唾液接种给家兔，能够在家兔复制出狂犬病，但是在显微镜下见不到，可以利用的各种分离和培养细菌的方法都试过了，就是得不到毒性巨大的狂犬病病原体。巴斯德确定这种具有侵染性的病原体是一种极微小的微生物，巴斯德称其为“Virus”。Virus一词，作为微生物学名词，有3种解释：病毒，传染毒，滤过性病原体(新英汉词典，1978)。带有“Virus”的词一般均具有“毒”的含义(如Virulence，毒力)。巴斯德可能是病毒发现之前，第一个将现在已知为病毒(Virus)的病原微生物称为“Virus”的科学家。“Virus”一词引入中国后，曾译为“毒素”，“微子”，后来改称为“病毒”，即能致病的毒物[10]。

巴斯德观察与分析了实验狂犬的发病过程，认为狂犬病是以中枢神经系统损害为主要特征，因此确信狂犬病毒不是通过血液发生作用的，而是通过神经系统发生作用。只要病毒尚未深入到中枢神经，它就可能在身体的其他部位潜伏起来，甚至可以停留几个月或几年之久，这就是常说的潜伏期。在病毒没能达到中枢神经系统之前，被咬者便可以侥幸地活着。为了进一步验证，巴斯德把疯狗身上的血液抽出来，然后注入健康的狗体内，结果被注射的狗根本没有发病。这一结果表明巴斯德的推断完全正确——狂犬病毒不在血液里。那么，是否存在于疯狗的脑髓中呢？巴斯德做了开颅接种的实验。他将麻醉后的狗绑在手术台上，用环锯揭去一小块圆形的颅骨后，露出脑膜，然后在脑膜上注射了少量的疯狗的脑髓，最后缝合伤口。狗恢复知觉后看上去健康如常，但在14 d后出现了狂犬病的症状，最后瘫痪死去。该实验证明了狂犬病毒存在于疯狗的脑髓中。虽然看不到狂犬病毒，也没有分离到，但巴斯德终于得到了可靠证据——可以利用的集中含有巨大毒性的狂犬病毒载体——疯狗脑髓。

3.2 兔脑传代与干燥减毒

巴斯德获得了含有强大毒力的，患狂犬病的狗的脑髓材料后，为了有效而可靠地保存毒力巨大的狂犬病毒菌种，便于开展持续的研究，巴斯德改用兔脑接种传代保种。他把兔子的脑盖揭开，注射入疯狗的延髓液，过了18 d，兔子发病死亡。兔子死后，巴斯德迅速取出其延髓液，移入另一只活兔子的脑中。兔对狂犬病毒十分敏感。在传代接种过程中发现随着传代次数的增加，兔发病的潜伏期逐渐缩短，说明狂犬病毒随着兔脑传代毒力逐渐增强。连续传代9次时，其潜伏期由15～20 d缩短至6～7 d。潜伏期可以作为衡量病毒对兔毒力的评判标准。巴斯德此时创立了直至现在仍在狂犬病毒研究中奉为经典的街毒与固定毒的理论。

巴斯德把从自然感染的疯狗中获取的病毒称为街毒(street virus)，街毒对人毒力强，而对家兔毒力弱。当把街毒接种到家兔脑内，需经14～21 d或更长时间的潜伏期后产生疾病。通过对家兔的连续传代后，对兔的毒力增加，潜伏期逐渐缩短，直到最终兔能恒定地在第6天或第7天发病和在第9天或第10天死亡，此时成为固定毒(Fixed virus)[11]。固定毒对兔已达到了高度恒定的毒力，而对犬丧失了毒力。在街毒感染的脑各部位的细胞内，能发现有包涵体，也称内基氏(Negri)小体，尤以海马角的锥体细胞与小脑中的普肯野氏(Purkinje)细胞内最多，是狂犬病毒生长繁殖的场所，而固定毒接种后，都不见包涵体。固定毒部分丧失了沿神经传播能力，不侵入唾液腺。

巴斯德在鸡霍乱疫苗中十分注意空气中氧对微生物毒力的作用，认为氧化使细菌毒力减弱；巴斯德也极其推崇时间对减低毒力的影响，鸡霍乱疫苗的减毒与保存时间的长短成正比关系。在炭疽疫苗中的关键影响因素是温度，提高了温度的培养使强大毒力的炭疽芽孢杆菌变成了弱毒。巴斯德可能总结分析了鸡霍乱疫苗，炭疽疫苗的成功经验，对已成为固定毒的兔脊髓创造了黑暗恒温环境中直接暴露空气14 d自然干燥逐日减毒法，来再次降低毒力。

巴斯德首先从死于狂犬病的家兔的脑桥或脊髓取得新鲜固定毒，并制成乳剂，取几滴乳剂注射于健康兔的硬脑膜下。一切操作必须严格无菌，以排除其他感染。试验家兔将于第6天或第7天开始出现症状，在第9天或第10天死亡。通常在让病兔自然死亡，在濒死前使用氯仿，以免最终感染和免除病兔不必要的痛苦。当动物一死亡，立即在消毒液内洗涤并解剖取出脊髓，并利用消毒过的细丝悬挂在预先消毒过的瓶子内，瓶底复以一块KOH作为干燥剂，置于20～22 ℃的暗室中，脊髓逐渐地在这样的环境中脱水干燥了14 d。脊髓经干燥变为枯萎，原本死于狂犬病兔子的脊髓曾经是极毒的，发现干燥14 d的含毒病兔脊髓失去了脑内感染家兔的能力，这样便使原来已成为固定毒的毒力又被减弱了。1884年，巴斯德用经干燥处理的含毒病兔脊髓以生理盐水做成悬液注射给23条健康犬进行免疫试验，采用的方法是用少量这种“兔苗”逐日给健康犬注射，最初注射经干燥14 d的含毒病兔脊髓，最后一针仅注射干燥1 d的含毒病兔脊髓，即共注射14次(天)。结果经注射接种过的健康犬在被疯狗咬伤后没有感染狂犬病，因而证明了健康犬通过接种能获得狂犬病的免疫性。

3.3 狂犬疫苗的第一次人体接种

1885年，巴斯德的研究成果见报后，立即引起了轰动。7月6日，9岁男孩约瑟夫·迈斯特由家人陪同，从法国东北部的阿尔萨斯(Alsace)地区来到巴黎，找到巴斯德实验室，约瑟夫在2 d前遭到一只疯狗的袭击，全身有14处很深的咬伤，已经几乎不能行走了。虽然巴斯德对狂犬病疫苗在狗身上实验的成功很有信心，但现在面对的是人，一个男孩。他非常慎重地考虑应不应该在这个男孩身上注射疫苗。巴斯德咨询了两位医生，他们都认为如果什么都不做，他极有可能会犯上狂犬病，肯定会死。于是巴斯德决定注射疫苗。当天晚上(距咬伤60 h)，就由助手给约瑟夫注射了第一针，这是干燥了14 d的含毒病兔脊髓的生理盐水悬液。按照预先制定的免疫接种顺序，先是从干燥贮存时间最长，也就是毒力最弱的疫苗开始。第二次是用干燥13 d的脊髓，后一针比前一针更为新鲜的疫苗，总共注射了13针，其中最后5针含有大量的活病毒[12]。7月16日，约瑟夫打了最后一针，接种材料取自死后仅1 d的兔子。治疗十分成功，巴斯德疫苗的免疫保护使约瑟夫免患狂犬病，巴斯德拯救了被疯狗咬伤的人。1885年7月6日，这是人类历史上值得永久纪念的日子，巴斯德发明的世界上第一支疫苗，狂犬疫苗首次用于人体，治疗获得成功。狂犬病疫苗成功了，开创了人类征服传染病的新纪元，开启了一个崭新的疫苗时代。

被巴斯德挽救的第一例狂犬病患者约瑟夫·迈斯特，长大以后成为了巴斯德研究所的守门人，忠实守护着巴斯德的墓园。1940年，纳粹德国侵占巴黎，纳粹侵略者强迫约瑟夫·迈斯特开启巴斯德坟墓的门，但被迈斯特拒绝了，用死来抗议，他开枪自尽。

3.4 巴斯德预防治疗法

狂犬病疫苗的成功，轰动了整个世界，人们纷纷把病人送到巴黎，送到巴斯德实验室(巴斯德研究所落成于1888年)，这个世界上唯一能拯救狂犬病人的地方。巴斯德制定免疫程序表，称为“Pasteur prophylactic treatment”(巴斯德预防治疗法)。

至1886年4月不到1年的时间内，预防治疗被疯狗咬伤者688人，仅1例无效死亡；被疯狼咬伤者38人，有3例死亡。至1886年10月治疗人数达2 470人，其中在法国和阿尔及利亚暴露治疗1 726人中，10例因病情延误而免疫失败。巴斯德估计失败的几率是1/170。失败者多为头面部或四肢深部咬伤的儿童。到1935年为止，约有51 057人在巴斯德研究所(巴黎)进行了接种，死亡率约为0.29%，即总共有151人死亡[13]。在预防治疗第一例狂犬病后的次年(1886年)，巴斯德研究所就接纳了2 671例，在1886～1914年的28年中，共接纳33 490例，死亡129例，总的治疗率达99.615%。无效死亡率为0.385%，除在头3年死亡率超过0.5%以外，其余26年死亡率都在平均数以下，在1912～1914年连续3年，均无死亡病例发生。而当时被疯狗咬后死于狂犬病的人在6%～10%，有时达16.6%，甚至更高。在Taudieu 收集到疯狗咬伤的855人中，死亡399人，死亡率为46.6%；Bouley报告在疯狗咬伤的266人中152人发病死亡，死亡率为57.1%，在脸部和手被咬伤更具危险。被狼咬伤的死亡率达60%～80%。

巴斯德减毒的狂犬病固定毒毒株保存于巴黎与世界各地许多实验室，并衍化生成了具有不同特性的PV，PAS，PM，CVS，AVO1等多种疫苗株[14,15]。用这种病毒制造疫苗，一直保持到现在。巴斯德创立的固定毒原理，狂犬病暴露后治疗及多次接种程序的巴斯德预防治疗法仍为狂犬病疫苗制备研究的经典。1899年，在巴斯德狂犬病首次人体接种后14年，这种当时世界上最先进的疫苗，即在我国上海引进应用。1899～1922年，我国即采用巴斯德原法制造疫苗[16]。1931年，北平卫生事务所袁浚昌从一捕获的狂犬脑中分离出1株狂犬病病毒，经当时的中央防疫处长齐长庆、李严茂通过家兔脑内传代演变成固定毒，称北京狂犬病固定毒[17]。于1933年始用北京株生产羊脑疫苗，持续使用近50年，直至1980年停用。1965年武汉生物制品研究所林放涛先生在北京株固定毒基础上培育疫苗aG株[18]。中国食品药品检定研究院严子林先生在1956年从山东博山一狂犬病死者脑中分离的街毒，经小鼠连续传代56代时，发病潜伏期从11～14 d缩短至3～6 d，为固定毒，又经KMB-17人二倍体细胞连续传代37代，获得狂犬病病毒二倍体细胞适应株，正式命名为中国济南1号(CTN-1)[19]。适用于疫苗生产，已获WHO第7次狂犬病专家委员会认可作为疫苗种子毒。虽然现今狂犬病疫苗以多种更完善的形式不断地推陈出新[20]，但狂犬病疫苗仍然遵循着巴斯德确定的原则与方向在不断前进。

疫苗在人类历史上创造的奇迹，显示了科学以无穷的力量改变着人类的命运，也使千百年来肆虐于世间的各种传染病不断被人类所征服。但不为多数人们所熟知的是，其中凝结着无数科学家的聪明智慧和辛勤汗水。其中最值得推崇和敬仰的两位伟大的科学家是英国乡村医生(也被誉为自然历史学家、免疫学家、医学家)爱德华·琴纳(Edward Jenner，1749-05-17～1823-01-26)和路易斯·巴斯德，其中琴纳首先发明了天花疫苗，是他们开启了预防医学和预防兽医学新时代的大门。我们今天在使用疫苗预防传染病的时候，不能忘记也永远不会这两位伟大科学家的历史功德。

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(责任编辑：朱宝昌)

Commemoration of the 130th Anniversary for Louis Pasteur Inventing Rabies Vaccine

YANG Zheng-shi1,2，FANG Hai2,3

(1 National Institute for the Control of Food and Drug, Beijing,100050;2 Hebei Province Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine;3 Department of Animal Science & Veterinary Medicine,Hebei Normal University of Science & Technology;China)

Louis Pasteur (1822～1895) was a great France scientist. He invented rabies vaccine, and successfully inoculated it to Joseph Meister, a boy serious bite by a mad dog in July 6, 1885, from then on, people took that day as a beginning point of vaccine era conquering infectious diseases, and it has been 130 years since then. Pasteur’s scientific career could be divided into three periods: 1.Chemistry period(before 1856); 2.the era of the life sciences (started in 1856 when contacted with microorganism fermentation); 3.the medical/veterinary era(marked by silkworm disease research). Pasteur contributed in many fields including chemistry, life sciences, medicine and agricultural sector, especially in the creation of prophylactic immunization invention and etiology theory. In exploring the vaccines, Pasteur found the key to vaccine——control the virulence of pathogens. He found Pasteurella multocida which could naturally attenuated chicken cholera pathogenic bacteria and made Bacillus anthracis virulence variation occur artificially. He successfully developed attenuated fowl cholera vaccine and anthrax vaccine. He established classical fixed virus theory through rabbit brain passage transfer, and developed a safe and effective rabies vaccine and the Pasteur prevention therapy. Although rabies vaccine kept changing for centuries, the principle is still under the guide of the Pasteur theory.

Louis Pasteur;rabies vaccine；preventive veterinary medicine

2015-11-15

10．3969/J．ISSN．1672-7983．2015．04．001

S813.25

A

1672-7983(2015)04-0001-08

杨正时(1938-)，男，研究员。主要研究方向：医学微生物学，生物制品和传染病控制。