变性梯度凝胶电泳（D GGE）技术在畜禽粪便厌氧发酵液中的研究进展

王 欣，苏小红，郭广亮，刘 伟，徐晓秋，高德玉

（黑龙江省科学院科技孵化中心，哈尔滨 150090）

变性梯度凝胶电泳技术（DGG E）目前是研究微生物群落的组成、多样性和动态性最重要的检测手段之一。传统的研究方法仅限于对有限的微生物进行培养，然后研究其形态学、生理生化反应等特征。随着分子生物学技术的发展，科研工作者将目光瞄准在开发微生物资源上，并且采用DGG E技术分析环境中的微生物群落结构，以期发现对环境有用的微生物群落，然后开发微生物制剂。研究发现，微生物群落对有机物质的矿化和氮、硫、磷等物质的移除至关重要［1］。利用DGG E技术探讨畜禽粪便厌氧发酵过程中微生物群落的各项指标，能及时反应系统中化学需氧量（COD）、挥发性脂肪酸（V F A）、氨氮、磷等的转化情况，对以畜禽粪便为原料的厌氧发酵技术和环境科学的发展有着重要的现实意义［2］。

1 DGG E技术的原理及优缺点

1.1 DGG E原理

变性梯度凝胶电泳技术［3］被应用于环境微生物领域已有一定历史，是基于双链DNA片段在变性梯度胶中不同的迁移速度而产生的不同解链行为，将聚合酶链式反应（PCR）产物中的长度相同序列不同的DNA标记分离，从而获得不同的条带，每个条带代表一类微生物菌群，条带的强弱代表菌群的多少，可根据实际情况分析挑选出条带较亮并具有代表性的片段切割回收［4-5］，并进行测序分析，最终根据所得序列比对并判断不同条带所代表的优势菌群类别［6］。

1.2 DGG E技术优缺点

目前DGG E技术已经广泛应用于分析环境中的蓝细菌、细菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性，DGG E技术不但提供系统中优势种群信息，而且还能同时分析多个样品，具有操作简便和可重复性的优点；然而由于现阶段研究手段的局限性，使得DGG E技术也存在许多的问题，关于DGG E技术的优缺点有以下几点论述。

主要优点：

第一，操作的简便性。样品可以不经培养，直接提取样品的总DNA，然后用细菌特定引物对其16s r DNA的可变区进行PCR扩增，DGG E直接分析扩增产物，然后对其条带进行切割测序［7］，一般在24h内即可获得结果。

第二，快速同时对比分析大量样品。权春善等［8］采用DGG E技术探讨了外界刺激对不同退化程度的内蒙古草原土壤微生物多样性的影响，经DGG E分离获得微生物群落多样性的DGG E指纹图谱表明，土壤经过强酸、超声波和高温处理后，其微生物群落多样性显著降低，经过强碱、漩涡震荡处理，其丰富度显著提高，而经过氧化氢酶的刺激显著提高了其丰富度。陈美军等［9］利用DGG E技术研究分析了太湖地区真核微型浮游生物的多样性，发现不同湖区浮游生物的DGG E指纹图谱存在显著差异，表明营养水平低的湖区的浮游生物种类较多，丰富度高。

第三，能跟其他分子生物学技术相结合。近年来，DGG E技术结合FIS H技术研究环境样品中的微生物群落结构和多样性是一种非常普遍和有用的手段，它能获得微生物的质量和数量信息，并能同时分析其空间分布特征［10］。DGG E技术与传统方法结合，如杂交测序、克隆测序、R T-PCR等，从而为人们认识更多的未知微生物资源提供有利途径。

另外，DGG E还具有以下特性：突变检出率高，突变检出率为99%以上；检测片段长度可达1kb，尤其适用于100～500 bp的片段；非同位素性，DGG E不需同位素掺入，可避免同位素对人体的伤害；重复性好，但该方法需要特殊的仪器，而且合成带G C夹的引物也比较昂贵。

主要缺点：

第一，DGG E受影响的因素较多，要想获得清楚的DGG E图谱，就要优化许多条件，如无菌操作、预处理、引物的选择、PCR扩增等条件。

第二，无法准确给出微生物的代谢活性、形态结构、细菌数量、基因表达水平及相互之间关系的信息［11］。

第三，由于现有分子生物学技术的局限性，DGG E不能保证将所有的具有一定差异的DNA片段完全分开，序列不同的DNA分子可能会迁移到凝胶的同一位置，可以考虑与传统方法结合来解决这一问题。

2 DGG E技术在畜禽粪便厌氧发酵液中的应用

畜禽粪便厌氧发酵液中含有较高浓度的COD、氨氮、磷以及未发酵完全的有机物等营养物质［2］，采用DGG E技术对发酵液中的微生物种群结构的各项指标进行分析，能及时反应系统中化学需氧量（COD）、挥发性脂肪酸（V F A）、氨氮、磷等的转化情况。目前国内关于畜禽粪便高温厌氧发酵液的DGG E技术报道较少，因此本文提出一种厌氧发酵液微生物多样性的DGG E检测试验，包括以下几个步骤［12-13］：

第一，试验样品基因组DNA的提取：取500m L发酵料液作为测试样品，使用DNA提取试剂盒对样品基因组DNA进行提取。

第二，基因组16S r DNA的PCR扩增：取1uL样品基因组DNA作为PCR反应的模板，分别采用1μL16S r DNA细菌通用引物P2、P3作为正反向引物，按照M ix配成25μL反应体系，使用PCR扩增仪扩增，PCR反应条件：本试验反应体系采用降落PCR策略，即：预变性条件 94℃ 5m in，94℃ 45s，60℃ 30s，68℃1m in，循环 20次（每两个循环降一度），94℃45s，48℃1m in，68℃ 1m in，循环 10 次，最后 68℃延伸 4m in。再用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存，以备后用。

第三，PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳分析：经反复试验，确定本试验的聚丙烯酰胺凝胶的变化浓度为45%～60%，具体制胶、点样、染色、照相等操作步骤参照赵兴青等人［14-17］的相关文献。

3 结论与展望

厌氧发酵系统是处理畜禽粪便的有效途径之一，而发酵液中各种微生物是维持系统稳定运行的关键因子，本文分析了DGG E技术的原理及优缺点，将DGG E技术应用到畜禽粪便厌氧发酵液中，可以用来分析不同时期发酵液中不同微生物优势菌群的种类及数量变化，指导厌氧系统的稳定运行。此外，随着D EE G技术不断发展，人们对环境中微生物群落结构的多样性也有了越来越深刻的认识。目前，能够描述微生物全部群落结构的单一技术还没有发现，希望学者能加强这一技术的开发，为沼气产生的微生物学机理研究奠定理论基础。

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