解淀粉芽孢杆菌发酵技术在生物防治领域的研究进展

赵晓宇，王佳龙，孟利强，张淑梅，沙长青

解淀粉芽孢杆菌发酵技术在生物防治领域的研究进展

赵晓宇1，2，王佳龙1，孟利强1，2，张淑梅1，2，沙长青3

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150020；3.黑龙江省科学院，哈尔滨150001）

通过介绍国内生物防治领域中解淀粉芽孢杆菌的液体发酵基本情况，总结了目前发酵中多添加可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨、花生饼粉、尿素、豆粕、牛肉膏、酵母膏作为碳氮源的使用可获得良好发酵结果。在发酵液中添加磷酸盐作为缓冲溶液，并加入适当的Mn2+和Ca2+有助于芽孢形成，对发酵中pH值水平、溶氧水平等工艺进行了综述，为后续的科研工作做了必要总结。根据目前国内研究情况，提出应努力应用更多先进的统计学分析手段，指导发酵技术。应进一步探讨通过实时调控发酵条件来控制发酵结果，应用连续发酵等技术，进一步发展解淀粉芽孢杆菌的液体发酵技术。

解淀粉芽孢杆菌；生物防治；液体发酵

微生物发酵是利用微生物在适宜的条件下，将特定培养基经过一定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。微生物发酵生产水平不仅取决于菌种本身的遗传特性，还需要供给合适的培养基和发酵条件。优化发酵工艺可以充分发挥菌种的潜在生产能力，提高生产效率，降低生产成本［1］。

自1955年我国开始报道生物防治以来，筛选获得了大量的微生物菌株，对多种作物的病害具有较强抑制作用。解淀粉芽孢杆菌为芽孢杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物，对植物病原菌具有强烈抑制作用［2］。该菌在自然界分布广泛，易分离培养，对人畜无毒无害，不污染环境；其代谢产物较为丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，生长快，稳定性较好［3］。以往对于解淀粉芽胞杆菌的应用主要作为工业产酶菌株，近些年关于解淀粉芽胞杆菌的研究不断扩大，在生物防治、果蔬保鲜、促生方面都出现了报道，具有广阔的应用前景。

1　培养基对生防菌发酵的影响

培养基是微生物细胞生长繁殖提供所需环境，发酵培养基主要用来满足微生物生长繁殖、代谢产物合成过程中的的营养物质及能量需求，并为细胞提供适宜的生存环境［4］。在微生物产品发酵的科研和生产工作中，由于菌种不同、生长阶段不同及发酵工艺条件的差异，所使用的培养基也不尽相同。普遍均含有含碳物质、含氮物质、无机盐以及维生素和水等。不同的微生物对营养的需求有所差异。因此，培养基的成分和含量对微生物的生长繁殖、代谢产物的生成及产品的分离纯化都具有重要的影响，其中碳源和氮源是最重要的影响因素。

凡能提供微生物营养所需的碳元素和氮元素的营养源，被称为碳源和氮源［5］。微生物可利用的碳源非常广泛，主要分为有机碳和无机碳两类，利用有机碳的微生物多数为异养微生物，目前所筛选获得微生物多数为异养微生物，因此，多选择有机碳为主的碳源作为培养基重要组成。在有机碳方面糖类是最为广泛的碳源，包括单糖、多糖和各种淀粉以及糖蜜等，而在工业生产上也选择麸皮、米糠、纤维素等作为碳源。应用在微生物发酵粉中的氮源的种类也非常广泛，实验室和生产上常用做氮源的材料有（NH4）2SO4、NH4NO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏及蛋白质含量较高的黄豆粉、鱼粉、花生饼粉、豆粕等。

刘京兰［6］将筛选获得的内生解淀粉芽孢杆菌CC09可溶性淀粉（碳源）5g/L、比例为3∶1的胰蛋白胨酵母粉混合氮源15g/L，在此条件下，Iturin A的产量可达到690mg/L，较优化前的提高了4倍。魏娇洋［7］筛选获得的可防治棉花黄萎病菌的内生解淀粉芽孢杆菌X-278，进行发酵优化后，在葡萄糖1.5%、花生饼粉2%的条件下活菌数量达到1.5×1010CFU/mL，对棉花黄萎病菌的抑菌圈直径为33.4mm。梁昌聪［8］将解淀粉芽孢杆菌C101培养基进行优化，结果表明，在选择蔗糖20 g/L、尿素4.0 g/L、豆粕4.0 g/L的条件下，芽孢含量提高了188%。张静［9］等研究的解淀粉芽孢杆菌及其分泌物对山茶灰斑病病原菌具有较好的拮抗作用，其菌株发酵最佳碳、氮源分别为葡萄糖和蛋白胨。洪鹏［10］探讨了解淀粉芽孢杆菌HF-01菌株液体发酵条件，最佳碳氮源为葡萄糖3.0%、酵母提取粉0.5%。马桂珍［11］研究的解淀粉芽孢杆菌GM-1菌株，碳氮源选择为蔗糖10g/L，牛肉膏16g/L，酵母膏3g/L。张淑梅［12］对内生解淀粉芽孢杆菌TF28液体发酵培养基碳氮源进行筛选，确定菌株TF28最佳培养基配方为:葡萄糖1%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.3%。章小洪［13］等研究发现，玉米粉对解淀粉芽孢杆菌BW-13产生抗真菌活性物质的促进效果非常明显，最佳培养基配方需要含有玉米粉32 g/L，蛋白胨9 g/L。

各类重要元素是生命活动必须的营养物质，无机盐可为微生物提供除去氮碳源以外的各种重要元素。例如，P、K、Na、Mg、Mn、Ca、S、Fe、Zn等。不同的微生物菌株对各类盐累元素需求各不相同。各类元素在发酵液培养基中所扮演的角色也不尽相同。P、S、Ca、Mg、Fe等协助细胞内一般分子的合成。Na等维持调节细胞内外的渗透压。Mg、Cu、Zn则是生物活性酶的激活剂。S、Fe、NH4、NO2等离子为微生物提供能量，NO3和SO4等离子是生命活动氢受体，Co、Mo则是特殊分子的组成部分。

解淀粉芽孢杆菌X-278的发酵所需元素为硫酸铵0.5%、碳酸钙0.1%、硫酸镁0.5%、氯化钠0.5%［7］。梁昌聪［8］研究结果显示，在培养基中添加2.0g/L的KNO3，2.4g/L的Na2HPO4，0.52g/L的KH2PO4，0.55g/L的（NH4）2SO4，1.0g/L的 NaCl，0.50g/L的 MgSO4· 7H2O，0.005g/L的FeSO4，0.0054 g/L的MnSO4，解淀粉芽孢杆菌C101最大理论芽孢含量为14.67×108个/mL。解淀粉芽孢杆菌HF-01菌株最适发酵培养基中添加氯化钠0.3%、硫酸镁0.1%［10］。马桂珍［11］研究的解淀粉芽孢杆菌GM-1菌株，在培养基中添加了0.4g/L的FeSO4。张淑梅［12］等在发酵内生解淀粉芽孢杆菌TF28培养基中添加硫酸锰0.01%和碳酸钙0.5%。章小洪［13］的研究是在培养基中添加Mn2+对解淀粉芽孢杆菌BW-13产生抗真菌活性物质的促进效果非常明显，添加量控制在5 mg/L。洪鹏则是在培养基中添加了一定量的Mg2+离子。

2　培养条件对解淀粉芽孢杆菌的影响

对于微生物来说，其可生长的pH值范围非常广泛，多数菌株在pH5～9可以正常生长，但在菌株生命活动过程中需要在最适pH值条件下，控制发酵过程。不同的发酵pH值菌株所代谢的产物有所不同，需要根据发酵目标确定最适发酵pH值。而且在发酵过程中，pH值会随着发酵时间的延长而改变，因此要在发酵过程中流加酸碱物质，调控pH值走向。

温度是影响发酵结果的最重要的因素，因为生命活动是一系列生物化学反应组成的，这些反应受温度的影响极为严重，因此必须在适合微生物生长的最佳条件下，才可获得最适的发酵结果。最适发酵温度意义是菌株分裂代时最短或生长速度最快时的培养温度。但最适发酵温度不完全等同于发酵速度最高的温度，也不等同于某一代谢产物累积最高时的培养温度，因此需要根据发酵目标去筛选获得适合本菌株的最佳温度。

氧气在微生物生长中扮演重要角色，因为解淀粉芽孢杆菌均为好氧菌，因此氧气是本菌株的必备发酵条件之一。在氧气的存在下，氧分子参与整个呼吸链作用，并做氢的最终受体，在超氧化物歧化酶和过氧化氢酶作用下完成生命活动。在发酵过程中在溶氧电极的检测下，可以获得培养体系内溶氧数值，而在一般的发酵条件下则是通过调整搅拌频率来控制溶氧。

以上3种因素是影响发酵条件的主要因素，但在发酵过程中，种龄、发酵时间、接种量也对发酵的过程和结果有一定的影响，因此在研究发酵过程中也不能忽视。

张静［9］等确定其防治山茶灰斑病的解淀粉芽孢杆菌，最佳优化条件为25℃、pH值6.0、每125 mL接种2 mL孢子悬液于300 mL锥形瓶中震荡培养，作用时间72h后，抑菌值达0.85。解淀粉芽孢杆菌HF 01菌株最佳发酵培养条件为初始pH值6.0～6.5、培养温度28℃、培养时间48 h、250 mL三角瓶装液量90 mL、接种量体积分数6%、摇床转速130 rpm。在最佳发酵培养基和培养条件下，菌株HF-01抑菌能力提高37.3%。洪鹏［10］等对解淀粉芽孢杆菌HF-01的发酵条件进行了优化，在初始pH 6.0～6.5，培养温度28℃，培养时间48 h，接种量6%，摇床转速130 rpm的条件下，菌株HF-01的抑菌能力可提高37.3%。解淀粉芽孢杆菌GM-1最佳发酵条件为:28℃，pH7.0，200rpm，摇床培养60h，种子液浓度在108cfu/mL水平，接种量为10%［11］。 张淑梅［12］确定菌株 TF28最佳发酵条件为:初始pH 7.5，培养温度30℃，发酵周期48 h，接种量2%，转数200 rpm。解淀粉芽孢杆菌BW-13最佳发酵条件为：初始发酵pH 5.0，接种量为4%，培养温度28℃，摇床转速200 rpm，培养时间144 h，比优化前提高28.94%［13］。

3　展望

确定适合研究目标的培养基组成和发酵条件是研究的重点，而如何应用现代的统计学、数学的方法去完成我们的实验目标、安排我们的实验、处理实验结果，会使我们的研究变得更为简而易行。目前基于现代统计学相关技术方法，得到广泛应用包括正交试验设计、均匀设计和基于计算机模拟技术的响应面法在发酵技术领域高速发展，越来越多的科研工作者应用统计软件对试验结果进行数学回归模拟达到优化目的。

根据目前的研究结果，在实验中调整各种参数来调控发酵的技术还未见报道，我们可以针对我们想要获得的某一指标调整某一发酵过程参数，来控制发酵结果，例如，在发酵过程中，升高或降低温度调整微生物生长速度，控制发酵过程中pH值的改变来中和发酵过程中产生的乳酸，我们经过试验已经证明可以对芽孢的形成速度有所影响，在发酵过程中控制溶氧的比例也会对发酵过程工艺有所调控。另外，在发酵过程中进行连续补料可能也会对最终产物的累积形成具有一定的意义。但这些在国内的文件中还未见报道，需要我们科技工作者不断的深入研究，为生物防治领域带来新的曙光。

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［13］ 章小洪，汪琨，朱廷恒，等.解淀粉芽抱杆菌BW-13培养基和培养条件优化［J］.浙江工业大学学报，2013，41（1）：35-39.

Research progress of fermentation technology of Bacillus amyloliquefaciens in the field of biological control

ZHAOXiao-yu1，2，WANGJia-long1，MENGLi-qiang1，2，ZHANGShu-mei1，2，SHAChang-qing3
（1.Institute ofMicrobiology，HeilongjiangAcademyofSciences，Harbin 150010，China；2.Institute ofAdvanced Technology，HeilongjiangAcademyofSciences，Harbin 150020，China；3.HeilongjiangAcademyofSciences，Harbin 150001，China）

By introducing liquid starch Bacillus fermentation solution in the field of domestic biocontrol basic situation，this paper reviews the soluble starch，glucose，sucrose，tryptone，peanut meal，urea，soybean meal，beef extract，yeast extract as the use of carbon and nitrogen sources and get a good result of fermentation in the current fermentation.Add broth as phosphate buffer solution，and add the appropriate Mn2+and Ca2+to help sporulation. The pH level，dissolved oxygen levels and other processes in fermentation were reviewed，serving as the necessary follow-up research.According to the current situation of domestic research，efforts should be made on more sophisticated statistical analysis application tools，guidance fermentation technology.Further exploration should be done through real-time regulation of fermentation conditions to control the fermentation results，apply continuous fermentation technology，advances in the development of the liquid fermentation technology of Bacillus amyloliquefaciens.

Bacillus amyloliquefaciens；Biocontrol；Fermentation

S476

A

1674-8646（2015）04-0018-03

2015-03-02

黑龙江省科技攻关项目（GZ13B017）；黑龙江省院所基本应用技术研究专项（CZ14BZXY14）；黑龙江省科学院学部委员项目（XB13CZXY14）

赵晓宇（1979-），男，黑龙江肇源人，副研究员，学士，主要从事生物防治、基因工程研究。

沙长青（1965-），男，黑龙江哈尔滨人，研究员，硕士，主要从事农业微生物领域研究。