树干毕赤酵母发酵木糖制备乙醇补料工艺研究

杨盛茹，丁长河，惠 明，殷丽君

（1.河南牧业经济学院 食品系，河南 郑州 450044；2.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

近年来，各国学者对燃料乙醇的研究逐渐深入，生产工艺也在不断改进.目前乙醇生产的重要技术分别是超高浓度（VHG，very high gravity）乙醇发酵工艺和纤维素乙醇工艺[1-2].纤维素乙醇工艺可节约原材料成本，但预处理纤维素原材料时存在衍生问题；乙醇发酵可节约能耗成本，但底物的超高浓度抑制酵母菌的生长和发酵[3-5].学者通过研究补料发酵调控策略将补料发酵技术运用于这两大乙醇生产工艺，在解决二者的上述问题方面呈现出一定的潜力[6].

近年来研究主要涉及补料时间、补料成分以及补料策略等方面[6]；宋向阳等[7]以树干毕赤酵母为菌种对摇瓶条件下木糖补料发酵进行研究，得出总糖浓度100 g/L、发酵28 h 内、补料2 次效果最佳，与一次性投料相比乙醇质量浓度提高了10.36%，达到37.49 g/L；杨功勋[8]通过将补料工艺和通气策略相结合，有效地提高了菌体的存活率，使得乙醇生产速率提高了36%，乙醇质量浓度提高了19%；Unrean 等[9]研究树干毕赤酵母发酵葡萄糖和木糖混合物生产乙醇时，以动力学模型确定最佳补料培养基和补料策略，与分批发酵相比，乙醇产率和乙醇产量分别高出2 倍和1.3 倍，乙醇质量浓度为40.7 g/L.

本试验在前期系统研究基础上[10]，进一步研究5 L 发酵罐条件下补料工艺对树干毕赤酵母生长规律和发酵生成乙醇的影响，以期进一步提高木糖利用率和乙醇产量，为燃料乙醇的工业化生产提供理论和技术基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

树干毕赤酵母（P.stipitis）m4：石蜡冷冻 保藏，由河南工业大学保存.

1.1.2 试验培养基

固体培养基：木糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，琼脂粉20 g/L，酵母膏10 g/L，pH 自然，121 ℃、0.1 MPa下灭菌15 min，其中木糖与其他物质分开单独灭菌.

种子培养基：木糖150 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母 膏10 g/L，（NH4）2SO40.2 g/L，FeSO4[7H2O]50 mg/L，MnCl2[4H2O]25 mg/L，ZnSO4[7H2O]11 mg/L，pH 自然，121 ℃、0.1 MPa 下灭菌15 min，其中木糖与其他物质分开单独灭菌.

发酵培养基：木糖（依据试验具体要求称量），蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，（NH4）2SO40.2 g/L，生物素0.5 mg/L，FeSO4[7H2O]50 mg/L，MnCl2[4H2O]25 mg/L，ZnSO4[7H2O]11 mg/L，pH 4.8.在发酵罐中121 ℃、0.1 MPa 下高压蒸汽灭菌30 min，其中生物素用0.22 μm 膜过滤除菌，木糖与其他物质分开单独灭菌.

硫酸锌、硫酸铵、生物素、氯化锰、硫酸亚铁：分析纯，洛阳市化学试剂厂；酵母膏、蛋白胨：生化试剂，北京奥博星生物技术公司；琼脂粉：生化试剂，上海山浦化工有限公司.

1.1.3 主要仪器

BMR-A10USIP Auzone 5L 发酵罐：上海傲中生物工程设备有限公司；GC-2010 气相色谱仪：日本岛津公司；UV-1901 紫外可见分光光度计：上海尤尼柯有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 摇瓶种子培养

固体培养基活化培养P.stipitis m4：在无菌环境下将液体石蜡冷冻保藏的P.stipitis m4 菌体迅速接种到新鲜的培养基上，28 ℃培养3 d.

取60 mL 灭过菌的种子培养基置入500 mL三角瓶中，在无菌环境下接种一环活化的酵母，在25 ℃、130 r/min 的条件下培养.620 nm 下其吸光度值（OD620）超过50 时结束培养，经5 000 r/min 离心10 min，后用无菌水溶解沉淀的酵母，放入4 ℃冰箱以作为发酵接种物.

1.2.2 发酵罐补料发酵

在发酵罐火焰圈保护下，将摇瓶培养好的种子按12.5%的接种量接入装有发酵培养基的5 L发酵罐中（工作体积为80%），控制温度28 ℃、转速300 r/min、通气量30 L/h，自动流加2 mol/L 氢氧化钠控制pH 值4.8，在不同时间、不同流加次数补入新鲜物料，培养周期为84 h，每隔12 h 测其酵母浓度，并快速取出1 mL 发酵液置入离心管中，经12 000 r/min 高速离心10 min，取其上清液测定乙醇质量浓度和还原糖含量（木糖残留量）.

1.2.3 分析方法

乙醇质量浓度测定方法:气相色谱法[11].

酵母浓度测定方法:浊度法[12].

木糖残留量测定方法:3，5-二硝基水杨酸（DNS）法[13].

2 结果与讨论

2.1 分批发酵中木糖浓度对乙醇生产的影响

试验研究了不同初始木糖浓度对分批发酵的影响，确定补料分批发酵试验中的木糖初始浓度以及总浓度.试验中木糖质量浓度分别为108 g/L、150 g/L，其发酵规律如图1、图2 所示.

图1 木糖浓度对酵母浓度与木糖残留量的影响Fig.1 Effect of xylose content on the concentration of yeast and xylose residues

从图1 可以看出，木糖质量浓度不同，P.stipitis m4 的发酵规律不同且有明显变化.当菌种转接到发酵液之后，酵母都经过短暂的适应后快速增长，木糖质量浓度较低时酵母生长速率较大.随着发酵时间延长，木糖逐渐被消耗，酵母增长速率均呈现降低趋势，在发酵不到36 h 后木糖质量浓度较高时酵母生长速率较大.在发酵60 h 后木糖大量被消耗，初始质量浓度为108 g/L 的木糖残留量仅为1.6 g/L，至此酵母浓度逐渐降低，至发酵84 h时木糖几乎消耗完毕；而初始木糖为150 g/L 时在60 h 时仍有大量残留，为35.3 g/L，至发酵结束时木糖仍有部分剩余，为13.1 g/L，而酵母浓度一直缓慢增加.

图2 木糖质量浓度对乙醇质量浓度的影响Fig.2 Effect of xylose content on ethanol concentration

从图2 可以看出，在发酵前60 h，木糖质量浓度为108 g/L 的乙醇产量均明显高于150 g/L 的.木糖质量浓度为108 g/L 时，乙醇质量浓度与酵母浓度变化趋势相同，即在发酵60 h 达到最高值50.0 g/L 后开始下降.这是因为在发酵后期，随着木糖逐渐消耗，酵母利用乙醇作为碳源使得产量降低.而木糖为150 g/L 时，随着发酵的进行，乙醇产量逐渐增加，直至发酵84 h 结束后，乙醇质量浓度达到最大值49.0 g/L，木糖利用率为91.2%.可能是因为产物抑制或者是因为底物质量浓度越高抑制作用越大，使得增加木糖质量浓度而最终乙醇产量却没有明显增大.

2.2 补料分批发酵对乙醇生产的影响

为进一步提高乙醇质量浓度和木糖转化率，消除P.stipitis m4 发酵过程中高浓度底物的抑制作用，或者弥补底物浓度较低时限制酵母细胞生长发酵的缺陷，研究补料发酵试验，确定发酵初始木糖质量浓度为108 g/L，控制木糖质量总浓度为150 g/L.

2.2.1 补料时间对乙醇发酵的影响

在合适的时间加入木糖，会刺激微生物生长、提高糖分利用速度.补糖过早，浓度过高达不到补料的作用；补糖过晚，已合成的产物因底物抑制就会阻碍菌体的生长[14].试验中分别在发酵24 h、36 h、48 h 时一次性补加木糖，控制木糖总质量浓度为150 g/L，研究结果如图3 所示.

图3 不同补料时间对乙醇发酵的影响Fig.3 Effect of feeding time on ethanol fermentation

从图3 可以看出，发酵24 h 时木糖剩余量维持在70 g/L 左右，乙醇产量在20 g/L 左右.此时补料，酵母浓度虽逐渐增加，但是乙醇质量浓度变化不明显，发酵结束时浓度稍有增加，为50.5 g/L，木糖残留量为10.3 g/L；在36 h 时，木糖含量为36.5 g/L，由于新鲜糖分的补入，酵母生长旺盛，发酵能力强，木糖含量迅速降低，最终乙醇质量浓度达到53.4 g/L，此时木糖剩余量为5.7 g/L；发酵48 h 时酵母浓度（OD620）为44.3，乙醇含量已经达到38.3 g/L，此时流加物料，糖浓度维持在60 g/L，此时酵母细胞浓度虽然大量增加但是最终乙醇含量并没有明显增加，最终为49.4 g/L，木糖残留量为14.1 g/L.综上所述，发酵36 h 为最佳补糖时间.

2.2.2 补加不同物料对乙醇发酵的影响

根据微生物培养基特点和生长状态，补料发酵时流加的物料可以是全料培养基，也可以是单独的碳源、氮源或者无机盐等.试验中在发酵36 h时分别一次性流加木糖和全料培养基，结果如图4所示.

图4 补加不同物料对乙醇发酵的影响Fig.4 Effect of feeding different materials on ethanol fermentation

从图4 可以看出，在发酵36 h 时分别一次性流加木糖和全料培养基，酵母浓度、木糖残留量以及乙醇质量浓度稍有变化.从图4 可以看出，在发酵前36 h，与补加全料培养基的发酵相比，补加木糖发酵因其他营养成分较充足，酵母在转接之后经过短暂的适应，其酵母浓度相对较高，而二者的乙醇生成量、木糖消耗量相似.在流加不同物料后，二者的酵母浓度、木糖消耗量并没有太大的改变，最终乙醇质量浓度维持在53 g/L 左右.在特定发酵条件和特定培养基下，补加全料培养基对于P.stipitis m4 发酵木糖生产乙醇影响不大.

2.2.3 补料次数对乙醇发酵的影响

补料次数越多造成发酵成本越高且染菌概率越大[14].试验中，在发酵36 h 时分别一次性流加木糖，在其前后完成两次补料，结果如图5 所示.

图5 补料次数对乙醇发酵的影响Fig.5 Effect of feeding times on ethanol fermentation

从图5 很明显地看出，二者的木糖转化利用情况相近，对于菌体，在经过短暂的适应后，36～60 h 内酵母生长繁殖的速度明显加快，且二次补糖时，酵母生长繁殖速度较大，乙醇产量变化趋势与之相近，在补料后均呈现出迅速增加的趋势，但二次补糖发酵48 h 时已经超过50 g/L，远远高于一次性补料发酵，最终乙醇质量浓度为54.9 g/L，木糖剩余3.9 g/L，为理论得率的67.1%.

3 结论

本试验以树干毕赤酵母m4 为发酵菌株，提高木糖浓度，在5 L 发酵罐中研究补料起始时间、补料次数以及补加不同物料时乙醇发酵的变化规律.结果表明，补料发酵时木糖初始浓度108 g/L，控制总浓度150 g/L，发酵84 h；在发酵36 h 时一次性补加木糖，酵母生长旺盛，木糖转化乙醇的速率较大，产乙醇量最高为53.4 g/L，且补加木糖与全料培养基发酵相比，乙醇浓度变化不大；分两次流加木糖发酵，乙醇产量最高，为54.9 g/L.与150 g/L、108 g/L 分批发酵相比，乙醇质量浓度分别提高了11.1%、19.3%，补料工艺进一步提高了乙醇的产量.此工艺可为其工业化生产提供理论依据.

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