乙型肝炎相关性肝癌根治性切除术后HBV二次激活的因素分析及机制探讨

江 涛，何 谦，张诚华，杜振双

·论著·

乙型肝炎相关性肝癌根治性切除术后HBV二次激活的因素分析及机制探讨

江 涛，何 谦，张诚华，杜振双

目的 通过观察乙型肝炎(乙肝)相关性肝癌患者行肝癌根治性切除术术前、术后血清乙肝病毒DNA(HBV-DNA)载量、血清炎症因子的变化，探讨HBV二次激活的因素。方法 将行肝癌根治性切除术、尚未达到抗病毒标准的60例乙肝相关性肝癌纳入研究，检测术前及术后第3天HBV-DNA、IL-6、IL-10、IL-27水平。根据术后第3天HBV-DNA载量变化将60例分为升高组(HBV-DNA载量升高1个及1个以上数量级)及正常组(HBV-DNA载量无变化或者升高不足1个数量级)。比较两组一般资料，筛选出影响HBV-DNA载量变化的相关因素进行多因素logistic回归分析。结果 ①术后第3天HBV-DNA载量较治疗前升高1个及1个以上数量级者27例(升高组)，其中21例(77.78%)术前HBV-DNA载量<104U/ml；HBV-DNA载量较治疗前无变化或者升高不足1个数量级者33例(正常组)。②logistic分析显示，肿瘤直径、肝切除范围、术中注射无水酒精是导致患者术后HBV-DNA载量升高的独立危险因素。③与本组术前比较，升高组术后第3天血清IL-10、IL-27水平升高(P<0.01)，IL-6无显著变化(P>0.05)；正常组术后第3天血清IL-6、IL-27水平升高，IL-10水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。结论 手术应激及其引起炎症因子IL-6及IL-10水平变化是乙肝相关性肝癌患者肝癌根治性切除术后HBV二次激活的可能机制；围术期监测患者HBV-DNA载量变化具有重要意义。

肝肿瘤；乙型肝炎,慢性；外科手术；乙型肝炎病毒DNA

我国是乙型肝炎(乙肝)高发国家，根据最新流行病学调查，目前约有3.5亿国民是乙肝病毒(HBV)的携带者。国际癌症协会于2009年调查发现,约80%的原发性肝癌患者与HBV有关[1]。自20世纪90年代我国普及乙肝疫苗以来，原发性肝癌的发病率有所下降，但仍有8% 90年代之前出生的人乙肝表面抗原呈现阳性[2]，故未来半个世纪乙肝相关性肝癌仍是我国一个重要的卫生问题。手术是目前治疗肝癌的主要手段，有文献报道化疗及经导管肝动脉化疗栓塞(TACE)可引发乙肝相关性肝癌患者体内HBV二次激活，进而导致肝功能的损害[3]，但肝脏切除术是否也可引起HBV的二次激活仍处于研究阶段。本研究将60例未达到抗病毒治疗标准的乙肝相关性肝癌患者作为研究对象，通过观察肝癌根治性切除术后患者血清HBV-DNA载量的变化，探讨HBV二次激活的因素及可能机制，为临床治疗提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象与分组 选择解放军180医院2011年1月—2013年3月收治的行肝癌根治性切除术的慢性乙肝相关性肝癌患者60例，男36例，女24例；年龄49～68(48.0±5.1)岁。纳入标准[3]：①经过影像学手段评估认为适合接受肝癌根治性切除术；②术前未接受任何形式的抗病毒治疗，术后病理切片证实为肝细胞癌；③HBeAg(+)者HBV-DNA载量低于105U/ml，HBeAg(-)者HBV-DNA载量低于104U/ml，丙氨酸转氨酶(ALT)低于80 U/L。排除标准：①既往接受过抗病毒治疗者；②既往接受TACE者或肝脏切除术后复发者；③合并严重心脑肾等重大脏器疾病者；④拒绝签署知情同意书者。根据术后第3天HBV-DNA载量变化情况将60例慢性乙肝相关性肝癌患者分为升高组及正常组，其中HBV-DNA载量增加1个及1个以上数量级者为升高组,HBV-DNA载量与术前属于同一数量级者为正常组。

1.2 观察指标 术前及术后第3天检测血清白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-27(IL-27)、HBV-DNA水平。

1.2.1 IL-6、IL-10及IL-27检测方法：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测，研究对象空腹、操作无菌状态下用无肝素真空采血管采集肘静脉血5 ml，1 h内离心10 min(3000 r/min)，分离并吸取上层血清，即刻检测或4℃保存3 d内检测。检测前样本恢复至室温，不可反复复温。ELISA试剂盒由广州达安基因股份有限公司提供，酶标仪、洗板机由上海沪峰生物科技有限公司提供。根据说明书进行上样、孵育、洗涤、加酶标抗体、显色、数据读取。在ELISA检测仪上，于450 nm[若以总抗氧化能力检测法(ABTS)显色，则于410 nm]处，以空白对照孔调零后测各孔吸光度(OD)值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

1.2.2 HBV-DNA检测方法：采用荧光聚合酶链反应(PCR)定量检测，根据NCBI中Genebank基因库的设计引物序列，扩增片段长度100～300 bp。用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水过夜室温或37℃处理,1.5 ml EP管和取液用10、200 μl和1 ml Tip,高温蒸气灭菌，80℃烘干备用。加入1 ml Trizol剪碎，振荡30 s；加0.2 ml氯仿，12000 g、4℃离心15 min；轻轻吸取上层无色水相至0.5 ml EP管中；加等体积异丙醇后12 000 g、4℃离心10 min；在管底部可见微量RNA沉淀。加入75%乙醇1ml，弃上清，干燥后用DEPC水溶解RNA，根据所RNA浓度，计算RNA体积。Real-Time PCR操作方法按照试剂盒说明书，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内部参照，将GAPDH的拷贝数作为校正基数，通过ABI7500软件获得检测指标循环阈(cycle threshold,Ct)值，与同样本中GAPDH的Ct值相减，即获得该样本中相应指标的ΔCt值。

2 结果

2.1 手术情况 60例手术均顺利，未出现肝性脑病、难治性腹水等严重并发症，无一例死亡。

2.2 术后HBV-DNA载量变化及分组 术后第3天HBV-DNA载量较治疗前升高1个及1个以上数量级者27例(升高组)，其中21例(77.78%)术前HBV-DNA载量<104U/ml；HBV-DNA载量较治疗前无变化或者升高不足1个数量级者33例(正常组)。

2.3 术后不同HBV-DNA载量两组一般资料比较 肝切除范围、肿瘤直径、术中注射无水酒精与HBV-DNA载量升高有一定的相关性(P<0.05，P<0.01)，见表1。

表1 乙肝相关性肝癌患者根治性切除术后不同乙肝病毒-DNA载量两组一般资料比较

2.4 术后HBV-DNA载量升高多因素logistic回归分析结果 多因素logistic回归分析显示，肝切除范围、肿瘤直径、术中注射无水酒精是导致HBV相关性肝癌患者根治性切除术后HBV-DNA载量升高的独立危险因素(P<0.05)，见表2。

表2 乙肝相关性肝癌患者根治性切除术后乙肝病毒-DNA载量升高多因素logistic回归分析结果

2.5 两组术前、术后血清炎症因子变化比较 与本组术前比较，升高组术后第3天血清IL-10、IL-27水平升高(P<0.01)，IL-6无显著变化(P>0.05)；正常组术后第3天血清IL-6、IL-27水平升高，IL-10水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表3。

3 讨论

近年来研究证实乙肝相关性肝癌患者体内的HBV可在化疗过程中被再次激活，导致肝功能进一步受损[4]。这一现象在淋巴瘤、乳腺癌患者尤为明显，约26%淋巴瘤患者存在HBV感染，经过化疗治疗后约有47%HBV感染者出现HBV-DNA载量明显上升。有资料显示约有40%乳腺癌患者接受化疗后出现HBV-DNA载量上调[5]。汤靓等[6]进行一项前瞻性多中心大样本研究显示，HBV再次激活是慢性淋巴瘤患者化疗预后的影响因子。

在我国约有2000万慢性乙肝患者，其中15%～20%转归为肝硬化，而肝癌是肝硬化最可能的演变趋势[7]。目前手术仍是肝癌的主要治疗手段，但手术对患者的免疫功能也会产生不良影响，可能导致HBV的二次激活。许彦杰等[7]证实原发性肝癌患者术后HBV-DNA载量升高与肝功能受损呈显著正相关，且HBV-DNA载量越高患者术后肝癌复发的可能性就越大。本研究对60例术前未达到抗病毒治疗标准的乙肝相关性肝癌患者进行研究，发现有45%的患者术后HBV-DNA载量升高，其中77.78%(21/27)术前HBV-DNA载量<104U/ml。传统观点认为术前HBV-DNA载量越高的患者术后HBV激活的概率越高[7]，但是本研究结果却显示术前低HBV-DNA载量的肝癌患者术后同样易出现病毒激活，提示术前低病毒载量的患者围术期同样不能忽视抗病毒治疗。

表3 乙肝相关性肝癌患者根治性切除术后不同HBV-DNA载量两组术前、术后血清炎症因子水平变化

本研究对患者的临床资料行进一步分析发现，年龄、性别、血清ALT、门静脉高压、Child-Pugh分级、甲胎蛋白、肿瘤距切缘距离、多发病灶、手术时间、组织学分化均与术后HBV-DNA载量升高无关，而肝脏切除范围、肿瘤直径、术中注射无水酒精是导致患者术后HBV-DNA载量升高的独立危险因素。肝癌根治性切除术后仅有功能正常的肝组织存留，体内多种细胞因子的诱导破坏了肝细胞内相对平衡的免疫状态，许彦杰等[7]认为术后肝组织容易产生代偿性再生，而HBV具有显著的嗜肝性，对代偿再生的肝脏新组织继续侵犯，从而导致HBV-DNA载量升高。因此笔者推测，当肝肿瘤直径<5 cm时，肝组织切除范围较少，代偿再生的肝组织较少，再次被HBV侵犯的肝体范围不大，HBV-DNA载量变化不明显；当肿瘤直径≥10 cm时，切除的肝组织范围较大，大量的HBV伴随肝组织被移出体外，存留的肝组织体积较小，短时间内代偿再生能力较低，患者术后HBV-DNA载量变化同样不明显；肿瘤直径为5～10 cm的患者，手术切除后肝组织代偿再生明显，HBV有了大量复制侵犯的条件，故术后HBV-DNA载量明显上调。本研究还发现术中注射无水酒精也是术后HBV-DNA载量升高的独立危险因素，具体机制目前尚未明了，有待进一步研究证实。

本研究进一步探讨术后HBV二次激活的机制，发现免疫功能下降增加了HBV二次激活的风险。有资料显示,IL-6可抑制HBV的复制，IL-6水平下降提示患者免疫功能下降，HBV将可能进一步复制[8]。本研究结果显示，正常组术后第3天IL-6水平显著高于术前，提示IL-6浓度的升高抑制了HBV复制，因此正常组HBV未出现明显二次激活现象。目前诸多文献证实IL-10是人体多效细胞因子,在免疫系统中发挥免疫抑制效应，机体免疫功能随着IL-10浓度增加而降低，病毒复制越明显，其对机体侵犯的可能性就越大，加速了宿主肝细胞转化成肝癌细胞的进程[9-10]。本研究中升高组IL-10水平与术前比较升高，而正常组具有相反趋势。这一结果与刘兰等[9]的研究结果一致。本研究结果还显示两组术后第3天IL-27水平均较术前升高，说明IL-27浓度变化与HBV再次激活无关，但有研究认为IL-27在HBV感染初期具有保肝效应，且具有抑制肿瘤细胞过度增殖的作用[11]，所以笔者认为，虽然IL-27浓度水平变化与HBV二次激活无关，但其高表达亦属于机体自我保护HBV破坏肝组织的表现。

总之，肿瘤大小、肝切除范围及术中注射无水酒精是乙肝相关性肝癌患者根治性切除术后HBV二次激活的独立危险因素，手术应激及其引起炎症因子IL-6及IL-10水平变化是HBV二次激活的可能机制，因此，围术期监测患者HBV-DNA载量变化具有重要意义。

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Factor Analysis and Mechanism Research of the Second Activated Hepatitis B Virus DNA in Patients with HBV-related Hepatocellular Carcinoma after Hepatic Carcinectomy

JIANG Tao, HE Qian, ZHANG Cheng-hua, DU Zhen-shuang

(Department of General Surgery, 180 Hospital of PLA, Quanzhou, Fujian 362000, China)

Objective To observe the changes of serum hepatitis B virus DNA (HBV-DNA) capacities and inflammatory factors before and after the hepatic carcinectomy in patients with HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC)， and to investigate the risk factors of the second activated HBV DNA. Methods A total of 60 HBV-related HCC patients undergoing hepatic carcinectomy without the recommended level of antiviral treatment were recruited in this study. The levels of serum HBV-DNA， IL(interleukin)-6， IL-l0 and IL-27 before and on the 3rdd after the operation were detected. The patients were divided into the increasing group (increasing HBV-DNA load ≥ 1 magnitude order) and normal group (increasing HBV-DNA load ≤ 1 magnitude order) according to HBV-DNA loads on the 3rdd after the operation． The general data in the two groups were compared, and then logistic regression analysis was performed for choosing related factors of HBV-DNA loads. Results There were 27 patients in the increasing group including 21 patients (77.78%, 21/27) with preoperative serum levels of HBV-DNA less than 104U/ml; there were 33 patients in the normal group. Logistic regression analysis showed that tumor diameter, hepatectomize extent and intraoperative anhydrous alcohol injection were independent risk factors for postoperative HBV-DNA load increases. Compared with those before the operation, in the increasing group on the 3rdd after the operation, serum IL-10 and IL-27 levels were significant increased (P<0.01), but there was no significant difference in IL-6 level (P>0.05). Compared with those before the operation, in normal group, serum on the 3rdd after the operation, serum IL-6 and IL-27 levels were increased, while IL-10 level was decreased, and the differences were statistically significant (P<0.05，P<0.01). Conclusion Surgical stress and its induced changes of inflammatory factors IL-6 and IL-l0 levels may be possible mechanisms of the second activated HBV-DNA in patients with HBV-related hepatocellular carcinoma after the hepatic carcinectomy, and it is important to monitor changes of HBV-DNA load in perioperative patients.

Liver neoplasms; Hepatitis B, chronic; Surgical procedures； HBV-DNA

362000 福建 泉州，解放军180医院普通外科

R735.7；R512.62

A

2095-140X(2015)08-0033-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.08.009

2015-05-16 修回时间:2015-06-09)