禽偏肺病毒检测方法研究进展

王　艳，庄金秋，梅建国，姚春阳，沈志强（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）



禽偏肺病毒检测方法研究进展

王艳，庄金秋，梅建国，姚春阳，沈志强
（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

摘 要：禽偏肺病毒病是严重危害家禽业的主要疾病之一。论文概述了禽偏肺病毒实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面，主要依靠病毒分离培养、ELISA法等病毒特异性抗原及其抗体的检测等。在分子生物学方面，主要依靠国内外相继建立起来的RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、LAMP和核酸杂交技术等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性，为临床兽医科技工作者使用快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。

关键词：禽偏肺病毒；检测；酶联免疫吸附试验；分子生物学方法

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV），又称为火鸡鼻气管炎病毒（Turky rhinotracheits virus，TRTV），早期称为禽肺病毒（Avian pneumovirus，APV）。aMPV属于副黏病毒科、肺炎病毒亚科、偏肺病毒属成员，是从人群中分离到人偏肺病毒（Human metapneumovirus，hMPV）后，被重新分类为禽偏肺病毒［1］。该病毒常引起以家禽呼吸道症状、头部肿胀和产蛋率下降为主要特征的疾病，是侵袭家禽上呼吸道的一种高度传染性病毒，可对世界范围内的养殖业造成严重的经济损失。aMPV感染火鸡后可引起温和或中度上呼吸道感染-火鸡鼻气管炎（Turky rhinotracheits，TRT）；感染肉鸡可引起鸡的温和型上呼吸道或中枢神经系统疾病-肉鸡肿头综合征（Swollen head sydrome，SHS）；感染产蛋鸡可导致产蛋率下降、孵化率降低等［2］。aMPV于1978年首次在南非报道之后，现已在世界许多国家都有分布。我国沈瑞忠等于1998年首次分离并报道了该病毒［3］。目前，aMPV分为A、B、C、D 4个亚型，其中A亚型和B亚型在世界各地均有报道，C亚型和D亚型分别在美国和法国有报道［4］。aMPV感染没有特征性的临床表现和病变，且常会与禽传染性支气管炎病毒、支原体、禽波氏杆菌、鼻气管鸟杆菌和禽流感等呼吸道病原体相互混淆。试验证明当aMPV与其他病原协同作用时可以加重和延长临床症状并增加病死率。近年来，aMPV感染给世界养禽业造成了巨大的经济损失和严重的动物福利问题，尤其是一些火鸡饲养大国，从而引起许多国家的高度关注。目前对aMPV感染尚无有效的治疗药物和方法，因此，做好该病的预防控制，特别是快速而准确的诊断方法的建立受到国内外学者的广泛关注。本文就aMPV检测技术研究进展方面做一综述，以期对禽偏肺病毒病的深入研究和疾病防控提供参考。

1　病毒分离与鉴定

病料多采集自感染aMPV病禽的气管、肺脏以及眼鼻分泌物，或鼻窦、鼻甲刮下的组织。应尽早对样品进行采集并立即送检，因为aMPV可能最多在鼻窦和鼻甲中存在6d～7d。用临床症状较为严重的鸡进行病毒的分离很少有成功的先例，一般认为临床症状的出现是由aMPV感染后继发感染其他病原微生物所导致的。

1.1鸡胚培养

6日龄～8日龄SPF鸡胚或火鸡胚可用于病毒的分离。经卵黄囊接种aMPV后第8d收集尿囊液和卵黄囊膜进行匀浆，接种继代培养。经多次继代培养后，胚胎发育受阻，胚体表面出血，甚至死亡。这种方法费时费力，需要连续传代很多次才能稳定的致死胚，而且往往分离病毒失败。1980年，南非最早的aMPV毒株是采用这种方法得到的。C亚型的aMPV也是采用这种方法分离得到的［5］。

1.2气管环培养

适合的病毒培养物首选为即将岀壳的SPF鸡胚或火鸡胚的气管环，也可用无aMPV抗体的1日龄～2日龄的雏鸡制作气管环培养物。这种培养物可以维持数周，接种样品之后观察纤毛运动的停滞，一般在aMPV感染1周后纤毛活动停滞。而观察到恒定的病变时，还要继续培养几代。一些早期分离到的A亚型和B亚型aMPV都是通过用这种方法得到的。在气管环培养（TOC）中，A和B亚型aMPV感染10d后造成纤毛活动停滞，但在接种后3d～5d里病毒滴度就达到高峰，因此野外材料在接种TOC后间隔3d～4d进行盲传，每次盲传后留一部分TOC用作纤毛运动活性检查。但是，TOC并不适合C亚型病毒的分离，因其不能使纤毛运动停滞。有研究表明，利用TOC法培养，aMPV传代98次后病毒的毒力仍没有丢失。相比之下，aMPV在其他细胞上传代，可迅速使病毒毒力致弱。因此，使用aMPV弱毒株作为疫苗，很可能出现毒力返强现象，从而引起免疫个体发病，甚至出现散毒的危险。

1.3细胞培养

aMPV可在多种原代和传代系细胞内增殖。最常用原代细胞有鸡胚成纤维细胞（CEF）或火鸡胚成纤维细胞（TEF）和鸡胚肝细胞（CEL）；传代系细胞有鸡胚成纤维细胞（DF-1）和非洲绿猴肾细胞（Vero）等。鹌鹑成纤维细胞（QT-35）也曾被用于美国C亚型aMPV的早期分离。另外，Patnayak D P等［6］证明了aMPV也可在黑长尾猴肾细胞（BGM-70）、罗猴胎儿细胞（MA-104）、鼠源的麦科伊细胞（Mc-Coy）、幼仓鼠肾细胞（BHK-21）以及牛胚肾细胞（MDBK）等传代细胞系上增殖。病毒在细胞中经多次继代培养后可产生细胞病变效应（CPE），其特征是细胞分散、变圆，并有合胞体形成。该方法在病毒早期分离中不一定成功，需要盲传多代才能出现一致的CPE。但是aMPV一旦适应了在鸡胚和TOC上生长，可在培养细胞上获得高滴度的病毒，培养7 d内可在细胞上呈现典型的合胞体CPE。对分离到的aMPV可通过电镜或免疫化学方法作进一步鉴定。

2　免疫血清学方法

2.1酶联免疫吸附试验

由于aMPV的分离鉴定比较困难，因此血清学方法常被用于商品家禽及其他禽类aMPV感染的诊断。血清学检测方法中，酶联免疫吸附试验（ELISA）是最常用的检测方法之一，该法操作简便，仅需要采集少量血清便可以对样品进行快速、灵敏的检测。现在国外已经有多种商品化和自主研制的aMPV抗体检测试剂盒问世，为临床监测提供了有利的工具。该方法可以同时检测大量的血清，有一些试剂盒甚至可以检测多种禽源的不同亚型aMPV。然而，在使用许多试剂盒检测不同亚型的aMPV时，敏感性和特异性方面却没有保证。主要原因是用来包被ELISA板的抗原变异和抗原不纯。Hafez H M等［7］分别应用3种不同的aMPV毒株作为包被抗原用于血清样品检测，从而对ELISA试剂盒的敏感性进行比较，结果发现并不是所有的包被抗原都可以检测到血清中的aMPV抗体。如果用异源毒株包被ELISA板，可能检测不到由aMPV疫苗诱导产生的抗体。加入A亚型或B亚型抗原的ELISA试剂盒对aMPV C亚型毒株抗体检测不敏感。也就是说，一般情况下，当用异株aMPV作为包被抗原，即使通过病毒中和试验出现很近的关系时，也不能很好的用于aMPV的抗体检测。一些竞争性ELISA试剂盒加入了入aMPV特异性单克隆抗体，为不同禽种的血清检测提供了可行性。然而，这种试剂盒不适用于C亚型aMPV美国分离株抗体的检测。近期，包含aMPV科罗拉多州分离株（Colorado株）和明尼苏达州分离株（Minnesota株）全病毒抗原的ELlSA试剂盒已经被研制和评估，这些试剂盒通过表达的M蛋白和N蛋白建立的双抗原夹心ELISA检测C亚型的MPV的抗体更加敏感和特异。我国对aMPV的研究相对匮乏，陈琳等［8］将纯化的B亚型aMPV重组G蛋白作为诊断抗原，建立了检测B亚型aMPV抗体的间接ELISA检测方法。该方法具较高的特异性和较好的可重复性，与IDEXX司生产的aMPV抗体检测试剂盒符合率为96.0%，可用于aMPV的血清学检测。应用该方法对山东省部分地区的商品蛋鸡、商品肉鸡和肉种鸡进行血清学检测，表明aMPV感染在山东省部分地区的鸡群中是广泛存在的，且以肉种鸡的阳性率为最高，商品蛋鸡阳性率最低。这一研究为aMPV诊断试剂盒的研制奠定了基础，并为该病的诊断与流行病学调查提供了有效的技术手段。贠炳岭［9］建立了检测aMPV抗体的间接ELISA方法，该方法与IDEXX同类ELISA试剂盒符合率为97.01%，适用aMPV的血清学调查和临床样品检测。

2.2病毒中和试验

可以应用敏感的细胞培养和TOC同时结合标准的病毒中和试验对aMPV抗体进行检测。A亚型和B亚型aMPV可以发生交叉反应。病毒中和试验（VN）耗时、昂贵，不适合禽场的大规模血清学筛选。

2.3免疫荧光试验（IFA）

荧光抗体检测是一种非常好的检测方法，已经有很多相关报道，如Naylor C J等［10-11］，但是该方法并不适用于大量血清样品中aMPV抗体的检测。

2.4乳胶凝集试验

乳胶凝集试验具有快速、简便、准确、特异性强、重复性和稳定性良好等优点，是一种适于基层单位检测aMPV的可靠方法。裴苹苹等［12］建立了aMPV乳胶凝集试验检测方法并将其用于临床病料的检测。aMPV抗体致敏乳胶无自凝性、特异性强、质量稳定、检测结果可靠，为aMPV的快速诊断提供了一种简单、有效的方法。

3　分子生物学方法

3.1RT-PCR技术

RT-PCR技术是检测aMPV的常用方法。应用RT-PCR技术检测时需要充分考虑当地的流行亚型，以便为是否需要设计亚型特异性引物提供参考。例如，在欧洲有4种亚型，同时在美国就只有一种C亚型。通常以F、G和M基因作为目的基因建立的RT-PCR方法，不能用于检测所有的亚型。而针对N基因的保守区设计引物建立的RT-PCR方法，能够检测A、B、C和D四个亚型。阳性样品可以进一步通过亚型特异性引物、序列分析和限制性片段长度分析等确定其亚型。Woade A A等［13］利用RT-PCR方法对我国南方部分地区A亚型aMPV的感染率进行统计，阳性检出率高达39%，但是B亚型为阴性。Ongor H M等［14］利用RT-PCR方法对土耳其火鸡进行检测，阳性检出率为2.9%。陈琳等［15］根据B亚型aMPV F基因的保守序列设计引物，建立了针对B亚型aMPV的RT-PCR检测方法。应用该方法对山东省492份具有呼吸道症状的商品肉鸡的肺脏病料进行检测，结果aMPV阳性检出率为43.09%（212/492），随机挑取11份进行克隆测序及序列分析，结果显示所扩增到的阳性产物均为B亚型aMPV。这表明了aMPV在山东省商品肉鸡群中普遍存在，且阳性率较高，应该引起足够的重视。薛聪等［16］建立了一种适用于B亚型aMPV的套式RT-PCR检测方法。应用本方法对采自山东省不同地区的64份可疑临床病料进行检测，阳性检出率为57.8%（37/64）。其所建立的套式RTPCR检测方法具有特异、敏感、实用等优点，为B亚型aMPV的快速诊断以及深入研究提供了更加可靠的方法。

3.2荧光定量RT-PCR技术

荧光定量RT-PCR技术比常规的RT-PCR灵敏度更高、特异性更强，稳定性更好，尤其适用于病毒感染的早期诊断。Guionie A O等［17］报道，实时荧光定量RT-PCR可作为aMPV检测的强有力的工具，用于aMPV各亚型的鉴定和量化。Kwon J S等［18］利用实时荧光定量方法对韩国A亚型和B亚型aMPV进行检测，结果商品肉鸡、肉种鸡和蛋鸡的阳性检出率分别为2.6%、3.8%和1%。鞠小军［19］利用RT-PCR扩增出B亚型aMPV F基因的目的片段，并将其导入克隆菌中制备出阳性标准品，建立了B亚型aMPV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。该方法具较高的特异性、灵敏度和较好的可重复性，可用于B亚型禽偏肺病毒的临床样品检测。王丽荣等［20］建立了针对A、B和C 3个亚群aMPV的荧光定量RT-PCR方法，灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍，适用于病原学检测，该方法为该病的早期诊断以及感染程度的定量分析奠定了基础。荧光定量RT-PCR检测aMPV的方法不仅能进行定性检测，更能准确定量，这就为aMPV感染、增殖规律的研究及病毒复制转录过程的研究奠定了重要基础。

3.3核酸探针技术

核酸探针技术是一种易于判定结果的分子生物学诊断技术，它是一种基于分子杂交技术的检测方法，可以检测核酸样品中是否存在特定目的基因。这种方法特异性较强，不需要特殊的仪器，适用于大量样品的检测，而且结果便于观察。目前常使用的探针标记方法包括放射性同位素法、光敏生物素法、地高辛标记法等。孙静等［21］利用地高辛标记的核酸探针对山东部分地区临床健康肉鸡群的多种呼吸道病原进行检测，aMPV检出率高达36.87%，而且多重感染现象比较严重，由此造成的损失难以估计。陈琳等［22］根据B亚型aMPV的F基因保守序列设计引物并用地高辛标记，制备出了地高辛标记的aMPV核酸探针。应用制备的探针对山东省不同地区的605份商品肉鸡和122份商品肉鸭进行了核酸探针检测，阳性检出率分别为36.59%和34.51%。表明aMPV在山东省商品肉鸡及肉鸭中普遍存在，且阳性率较高。核酸探针技术特异性强，敏感性好，但是该法操作较为繁琐，且不能对核酸进行进一步研究和探索。

3.4环介导等温扩增技术（LAMP）

RT-LAMP技术具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的特点，可应用于疾病的临床诊断。鞠小军［19］针对B亚型aMPV的F基因的保守区序列设计RT-LAMP引物，建立了B亚型aMPV的RT-LAMP检测方法。利用该方法对20份疑似aMPV样品进行检测，其阳性检出率为10%。结果显示，该方法具有较高的灵敏度和特异性，可用于B亚型aMPV的临床样品检测。RT-LAMP技术在B亚型aMPV的快速检测和防治方面发挥一定的作用，为aMPV的检测及疾病流行病学调查提供了可靠方法。

4　小结

目前，aMPV感染火鸡和鸡导致的疾病已成为危害世界许多国家和地区养禽业的重要疫病之一。特别是在火鸡养殖业，由aMPV引起的呼吸道疾病所造成的危害仅次于禽流感病毒，造成巨大的经济损失。aMPV作为家禽呼吸道病原体之一，在国外受到了高度的关注，尤其是一些火鸡饲养大国，但是在国内的研究却相对滞后。郭龙宗等［23］对我国等胶东地区不同周龄种鸡群的血清，通过aMPV抗体检测，发现在胶东种鸡群中普遍存在禽肺病毒感染，多个鸡群血清学达到100%的阳性率，鸡群普遍在开产前已经感染该病，最早的感染时间在6周龄～12周龄。徐仕忠等［24］通过对aMPV流行病学研究的文献资料及部分鸡群aMPV感染的血清学调查结果进行分析，结果证实，aMPV感染已经在中国的鸡群中广泛流行。在临床上，虽然单纯aMPV感染鸡不一定表现明显症状，但可以加重其他病原因子所致肿头、呼吸道病和产蛋下降等问题的严重程度并增加病死率。aMPV的感染也可造成全身性免疫抑制反应aMPV感染家禽后，常伴随着细菌的继发性感染，可使病死率增加25%～40%，对养殖业造成严重的经济损失。目前，疫苗接种和严格的生物安全手段是控制aMPV疾病的主要措施，但现有疫苗的安全性和有效性仍有待于进一步提高。因此加强对该病毒的研究，建立有效的诊断方法，是预防和控制该病的有效措施之一。对预防该病的发生，减少经济损失，保护和促进养禽业的健康发展具有重要意义。目前针对aMPV已建立了多种检测方法，这些方法的使用极大的方便了该病的及早诊断，使得疫情得以有效控制。然而这些方法各自存在不同的优缺点或苛刻要求，如有的存在操作繁琐、受检测材料限制、有的试验周期较长、有的对试验仪器及检测人员技术要求高等，这就需要实验室检测人员根据各自条件，综合选择并建立合适的检测方法，及时、准确、快速地监测疾病进行的发生、发展和流行，并提供有效的防控措施。另外，随着分子生物学的发展和人们对aMPV研究的不断深入，相信不久的将来，更多更为高效、敏感、特异、快速、简易而且价廉的检测方法将会被建立起来。

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Progress on Detection Methods of Avian Metapneumovirus

WANG Yan，ZHUANG Jin-qiu，MEI Jian-guo，YAO Chun-yang，SHEN Zhi-qiang
（Shandong Binzhou Animal Science &Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong，256600，China）

Abstract：Avian metapneumovirus（aMPV）disease is one of the main infectious diseases，which is seriously harmful to poultry industry.The laboratory methods for detecting aMPV were summarized in this paper. In the cell biology aspect，the detection of aMPV mainly depends on virus isolation and culture，specific antigen and antibody examination such as ELISA.In the molecular biology aspect，the detection methods mainly depend on RT-PCR and real-time RT-PCR，LAMP and nucleic acid hybridization.The advantages and disadvantages，and the practicality of the several of methods were introduced and compared.It can provide references for use of rapid，simple，accurate and practical methods to detect avian metapneumovirus.

Key words：Avian metapneumovirus；detection；ELISA；moleoular biology method

作者简介：王 艳（1976-），女，黑龙江哈尔滨人，硕士，助理研究员，主要从事兽医微生物研究及动物用疫苗研制。

收稿日期：2014-10-16

中图分类号：S852.657

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）06-0130-05