白细胞介素-23通过无翅基因相关整合位点/β-连环蛋白通路增强舌鳞状细胞癌抗凋亡及耐药能力

严嵚 苏玉婷 周月鹏 朱海涛 杨细虎 许建辉

1.江苏大学附属医院口腔科；2.放疗科；3.肿瘤实验室；4.影像科，镇江 212000

口腔癌约占全身恶性肿瘤的3%[1]，其中超过90%为鳞状细胞癌[2]。舌鳞状细胞癌作为最常见的口腔癌之一，约占我国口腔癌发病总数的40%。研究数据显示，我国口腔癌的发病对象正呈现出年轻化和女性化的趋势，发病率也在逐年上升，而由于肿瘤细胞异常的抑制凋亡能力，包括化疗在内的传统治疗手段对于控制其复发率和死亡率还存在明显不足[3-5]。目前研究[6-11]表明，B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）癌基因家族形成了细胞中主要的抑制凋亡蛋白，并在凋亡发生的效应期发挥调控的作用；三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）及P-糖蛋白（permeability-glycoprotein，P-gp）为代表的跨膜蛋白可直接与药物结合，充当广泛的药泵角色，主动参与到对化疗药物的拮抗过程中，而这些能力获得与无翅基因相关整合位点（Wingless-related integration site，Wnt）通路活化程度有着密切联系。近年来，免疫细胞及相关细胞因子对于肿瘤的调节作用逐渐成为了研究热点之一，白细胞介素-23（interleukin-23，IL-23）参与到多种肿瘤的增殖及转移过程中[12-16]。本研究旨在探讨IL-23的浸润表达程度与口腔癌恶性进程之间的联系，并进一步研究其对化疗抵抗能力形成的作用机制，为临床治疗提供理论及研究依据。

1 材料和方法

1.1 细胞、组织标本

舌鳞癌细胞株SCC9来源于美国模式培养物保藏所，由南京医科大学肿瘤研究中心惠赠，培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。收集2008年4月—2013年10月间江苏大学附属医院口腔科的舌癌患者组织标本28例。其中，男性15例，女性13例，年龄41～81岁，平均年龄60.43岁。组织学分级为Ⅰ级25例，Ⅱ级1例，Ⅲ级2例。所有标本经术后病理诊断证实为舌鳞状细胞癌。术后随访时间为11～77个月。

1.2 主要试剂和仪器

DMEM/F12培养液和胎牛血清（Gibco公司，美国），TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国），Prime-Script®RT reagent Kit（Perfect Real Time）和SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNase H Plus，Takara公司，日本），顺铂（cisplatin，DDP）（南京制药厂有限公司），重组人IL-23（R&D Systems公司，美国），Bcl-2、ABCG2、P-gp和β-连环蛋白（β-catenin）抗体（Cell Signaling Technology公司，美国），β-actin抗体和HRP标记的二抗（Santa Cruz公司，美国），Pierce ECL plus Substrate（Thermo Scientific公司，美国）。BB 15型CO2细胞培养箱（Heraeus公司，德国），5418R型台式高速冷冻离心机（Eppendof公司，德国），BioMate 3s型核酸测定仪（Thermo Scientific公司，美国），My Cycler型聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（BioRad公司，美国），Mx3000p型Real Time PCR扩增仪（Stratagene公司，美国）。

1.3 EnVision法进行免疫组织化学染色

石蜡切片，常规脱蜡、抗原修复、去内源性过氧化物酶以及血清封闭，一抗（IL-23，稀释度1︰100）4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育40 min，DAB显色，苏木精复染。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察。每例标本在显微镜下随机选择10个高倍镜视野（×400）。IL-23在标本中的表达强度评分标准如下。1）仅胞质为深棕色，呈强阳性，单视野中表达范围超过70%，记为3分；2）胞质为棕色，呈阳性，表达范围超过50%，记为2分；3）胞质为浅黄色，呈弱阳性，阳性区域占20%～50%，记为1分；4）胞质不着色为阴性或其他情况均不记分。PBS代替一抗而其他处理相同的标本作阴性对照组。

1.4 总RNA提取及逆转录

将105个处于对数生长期的SCC9细胞置于培养皿中，待12 h细胞贴壁后，分别加入浓度为10、50、100 ng·mL-1的IL-23，细胞培养箱中培养24 h后，根据TRIzol试剂说明书提取总RNA。核酸测定仪检测各样本RNA的A260/280为1.80～2.00。根据Prime-Script®RT reagent Kit产品说明书将各样本的总RNA进行反转录，取10 μL反应体系，反应条件：37 ℃，15 min（反转录反应）；85 ℃，5 s（反转录酶的失活反应）。

1.5 实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测SCC9细胞株中Wnt1和c-myc的mRNA表达

所有引物均由Invitrogen公司合成。Wnt1基因上游引物序列：5’-ATGGGGCTCTGGGCGCTGTTG-3’，下游引物序列：5’-CACACGTGCAGGATTCGATGG-3’；c-myc基因上游引物序列：5’-CTCTCAACGACAGCAGCCCG-3’，下游引物序列：5’-AGGTGATCCAGACTCTGACC-3’；内参GAPDH基因上游引物序列：5’-TCAACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游引物序列：5’-TGGGTGGAATCATATTGGAAC-3’。PCR反应体系25 μL，其中2×SYBR®Premix Ex TaqTM12.5 μL、10 μmol·L-1上游引物和下游引物各0.5 μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，cDNA模版2 μL，ddH2O 9 μL。以上所有反应过程均在冰上进行。反应条件为：95 ℃，30 s预变性；95 ℃，5 s变性，60 ℃，20 s退火/延伸，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

1.6 甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测IL-23对顺铂杀伤的拮抗作用

取对数生长期的SCC9细胞消化后制成单细胞悬液，并调整细胞密度为每毫升5×103个，接种于96孔板中，每孔培养液200 μL，待细胞贴壁分为10、50、100 ng·mL-1的IL-23预处理组与正常培养基组，24 h后IL-23预处理组将培养基换为：正常培养基或者含有2 μg·mL-1顺铂的培养基；正常培养基组将培养基换为：正常培养基或者含有2 μg·mL-1顺铂的培养基；每组设6个复孔。24 h或者48 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，孵育4 h，弃去液体，每孔加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，振荡10 min后，在570 nm波长下检测每孔的吸光度（optical density，OD），每相同设计组重复3次。设DMSO为调零孔，空白对照孔只加正常培养液。按下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=（1−实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

1.7 Western blot检测Bcl-2、P-gp、β-catenin、ABCG2蛋白的表达

将处于对数生长期的SCC9细胞株分为β-cateninsiRNA预处理组和未处理组。沉默β-catenin的靶向小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）正义序列：5’-GUCCUGUAUGAGUGGGAACTTdTdT-3’；反义序列：5’-GUUCCCACUCAUACAGGACTTdTdT-3’。24 h后分别换用含10 ng·mL-1IL-23培养基处理或正常培养基处理。继续培养24 h后提取总蛋白，分光光度计Biomate 3s测定蛋白浓度，煮沸变性，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭1 h，一抗（Bcl-2、P-gp、β-catenin、ABCG2，稀释度1︰1 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次40 min。二抗（HRP标记的IgG，稀释度1︰5 000）室温孵育1 h，洗膜3次后电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显影。

1.8 统计分析

采用SPSS 19.0软件分析数据资料，PCR结果使用非参数检验进行统计分析，P<0.05为有统计学意义；Western blot结果使用Alpha View软件进行分析。

2 结果

2.1 IL-23在舌鳞状细胞癌组织中的表达

免疫组织化学检测结果显示，IL-23在原位舌癌组织或者发生转移的癌组织及癌旁的正常组织中均有表达，但表达强度、范围及分布存在明显差异。具体表现为转移癌组织中IL-23的表达区域多超过70%，呈深棕色；原位癌组织中阳性区域低于40%，且棕色、黄色居多；癌旁组织分布散在，阳性区域普遍淡染（图1）。结合28例舌鳞癌患者的肿瘤特征及临床预后，统计后发现癌组织中IL-23的表达与肿瘤淋巴结转移（P<0.05）、神经侵犯（P<0.01）和治疗复发（P<0.05）相关，与其他因素相比较差异无统计学意义（表1）。

图1 28例舌鳞状细胞癌患者组织中IL-23的表达 免疫组织化学染色× 200Fig 1 IL-23 expression in 28 cases of tongue squamous cell carcinoma tissue from patients immunohistochemistry× 200

2.2 IL-23对Wnt通路转录起始的影响

经IL-23刺激后的舌鳞状细胞癌细胞株SCC9中Wnt1的表达明显上调（P<0.01）；同时，c-myc的转录水平也显著增强（P<0.01），0～10 ng·mL-1的IL-23范围内Wnt1和c-myc的上调具有浓度依赖性，并且在10～100 ng·mL-1的浓度范围内两者的表达均能维持较高水平，即IL-23可以显著增强Wnt通路活化（图2）。

表1 IL-23的相对表达水平与舌鳞状细胞癌患者临床及病理学特征的相关性Tab 1 The correlation of the relative expression levels of IL-23 and clinical-pathological features of tongue squamous cell carcinoma patients

图2 qRT-PCR检测IL-23处理后Wnt1及c-myc的mRNA表达水平Fig 2 The detection of mRNA level of Wnt1 and c-myc dealed with IL-23 by qRT-PCR

2.3 IL-23对SCC9细胞抗凋亡能力的影响及作用机制

Western blot法检测浓度为10 ng·mL-1的IL-23预处理24 h后SCC9细胞相关蛋白表达的变化，结果显示β-catenin、Bcl-2、P-gp、ABCG2均明显上调（图3上）。只作siRNA处理后，β-catenin明显下降，协同Bcl-2、P-gp与ABCG2相对表达水平均明显降低（P<0.01）；沉默β-catenin后，IL-23处理下Bcl-2、P-gp和ABCG2与对照组相比无明显变化（P>0.05）（图3下）。

2.4 顺铂检测IL-23的抗凋亡能力

IL-23可促进SCC9细胞的增殖（P<0.01）；IL-23预处理24 h后，顺铂处理组细胞表现出明显的抵抗作用（P<0.01）；48 h后抵抗能力有所下降（图4）。

图3 IL-23处理对抗凋亡相关蛋白表达的影响Fig 3 The effect of anti-apoptosis related proteins dealed with IL-23

图4 MTT检测IL-23处理前后SCC9细胞株的相对细胞活性Fig 4 Relative cell viability of SCC9 cells before and after dealing with IL-23 by MTT

3 讨论

近年来，越来越多的研究[17-18]表明IL-23作为促炎性细胞因子，其表达失衡紊乱不仅能引发类风湿关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮等多种自身免疫系统疾病，而且还能够促进肿瘤细胞的迁移和侵袭：如在肝癌发现IL-23可以通过上调基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）表达促进转移[13]；IL-23与肺癌细胞上受体结合后可促进增殖[14]；而乳腺癌患者外周循环中的IL-23表达强度与预后有关[15]；IL-23还可以促进转录因子Rel-A进核后增强口腔鳞癌细胞的增殖等[16]。本文通过对舌鳞状细胞癌患者病理组织与肿瘤进程的综合研究发现，IL-23异常表达与肿瘤患者的淋巴结转移、神经侵犯和治疗复发密切相关，其高表达常伴随着肿瘤复发和转移行为的发生，所以在随后的体外实验中对IL-23在舌鳞状细胞癌细胞恶性能力获得的具体调节作用作了进一步探讨。

目前，化疗是控制恶性肿瘤转移和复发的主要治疗手段之一。相对正常组织细胞，肿瘤细胞中普遍存在的耐药以及抗凋亡能力直接影响着临床治疗的效果及预后。治疗拮抗形成机制复杂，需要多重因素构成的内外环境共同调控，现有研究已经表明免疫细胞及其调节因子参与构成了肿瘤微环境，但其中IL-23在舌鳞状细胞癌细胞耐药能力获得中所起作用的研究还未见报道。作为调控耐药、抗凋亡、增殖、侵袭与转移的重要节点，Wnt/β-catenin通路在肿瘤细胞多种恶性行为形成中具有关键作用，其中β-catenin可直接进入细胞核中充当转录调控因子。具体表现为Wnt蛋白与Frizzled家族跨膜受体蛋白结合后，抑制糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）/轴蛋白（Axin）/大肠腺瘤息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）复合体继续对β-catenin的泛素化降解，使得β-catenin得以与T细胞因子/淋巴增强因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）结合，引起下游诸如cmyc、Bcl、ABCG、P-gp等表达上调[10-11,19]。其中，c-myc基因表达通常被认为是Wnt通路激活的标志[19]；而作为抗凋亡蛋白中代表性一员，Bcl-2能够显著增强肿瘤细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性，抑制化疗药物引起的细胞凋亡或者直接阻止激活凋亡的信号下游转导[5]；ABCG2和P-gp作为跨膜糖蛋白药泵，通过降低肿瘤细胞内药物浓度发挥拮抗化疗的作用，两者的异常上调直接影响肿瘤细胞化疗引起的抗凋亡能力的获得[6-9]。为了验证IL-23作用途径，首先在miRNA水平上证实了Wnt1及c-myc的表达上升与IL-23的作用浓度密切相关；在进一步证实IL-23刺激作用依赖于Wnt活化程度的相关实验中，结合siRNA技术沉默Wnt通路中关键信号蛋白β-catenin的表达后发现：预处理siRNA可降低IL-23促进β-catenin表达及对Wnt下游Bcl-2、ABCG2、P-gp表达上调作用。由此，推测IL-23对舌鳞状细胞癌细胞的抗凋亡能力的影响是通过显著加强了SCC9细胞的Wnt1表达，促使其分泌后作用于自身或者相邻细胞，活化Wnt通路造成胞浆内β-catenin进入到细胞核，结合核内转录因子并调节下游c-myc、抗凋亡及耐药蛋白的表达。为了模拟并验证化疗药物处理下，IL-23对舌癌细胞的影响，选择了常用化疗药物顺铂，其通过抑制肿瘤细胞内RNA以及蛋白质合成发挥广谱杀伤作用。实验结果进一步显示，IL-23预处理后舌鳞状细胞癌细胞抗凋亡能力得到加强，顺铂对其增殖无明显抑制。证实了IL-23刺激下可以削弱化疗药物对舌鳞状细胞癌细胞的毒性作用。

综合以上结果，本研究发现IL-23不仅参与到肿瘤组织的浸润、侵袭及复发中，而且在体外实验还首次证实了其具有增强肿瘤细胞抗凋亡及耐药能力的作用。IL-23作为主要由巨噬细胞及树突状细胞分泌的细胞因子，却在肿瘤的恶性行为形成中扮演着重要角色，这一现象的揭示，为深入研究免疫调节在肿瘤发展中的作用提供了有力的依据，对恶性肿瘤综合治疗方案的制定也具有重要的指导意义。

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