UPLC-Triple TOF-MS方法鉴定野漆树苷在大鼠体内的代谢物

刘 敬,王 清,辛贵忠,刘丽芳*,刘建群

(1.中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009；2.江西中医药大学，现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004)

UPLC-Triple TOF-MS方法鉴定野漆树苷在大鼠体内的代谢物

刘 敬1,王 清1,辛贵忠1,刘丽芳1*,刘建群2*

(1.中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009；2.江西中医药大学，现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004)

目的：分析野漆树苷在大鼠体内的代谢产物结构。方法：大鼠灌胃给予野漆树苷96 mg/kg 后，收集0～24 h 尿液及粪便样品，应用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱 (UPLC-Triple TOF-MS) 技术分析野漆树苷在大鼠体内的代谢产物。结果：共检测到了除原型药的4个代谢产物。经过对野漆树苷可能代谢产物的母离子和碎片离子的准确分子量及裂解规律的解析，并结合黄酮类化合物的可能代谢途径，推断出了这些代谢产物的结构。结论：上述实验结果将为血浆代谢产物的寻找提供靶标，为野漆树苷体内物质基础的确立以及体内代谢途径和代谢机制的研究提供重要的参考。

野漆树苷；大鼠体内；代谢物；UPLC-Triple TOF-MS

野漆树苷 (Rhoifolin，芹菜素-7-O-新橙皮糖苷，简称RH) 是来源于泡桐花、化橘红、山香及凤尾草等中药中的一种黄酮类活性成分[1]，具有抗氧化[2]、抗登革热、有助于胰岛素受体磷酸化等作用[3-5]。近年来，关于野漆树苷的报道越来越多，2010年版中国药典收录的山香及其制剂山香圆片的含量测定项就是以野漆树苷为指标成分的[6]。本实验室前期研究发现，大鼠灌胃给予野漆树苷后，在血浆中检测到野漆树苷原型药的含量较低，推测其在体内发生了广泛的代谢，可能主要以代谢产物形式存在于血液与组织中，因此有必要研究野漆树苷在动物体内的代谢途径。本实验灌胃给予大鼠野漆树苷后，采用 UPLC-TripleTOF-MS 法初步分析了野漆树苷在大鼠体内的代谢产物。

1 材料与方法

1.1 仪器

岛津LC-30A 液相色谱-AB Triple TOF 5600四极杆飞行时间质谱仪(数据采集AnalystTF1.6 AB Sciex，数据分析Peak View Software Version 2.0)；BS124S 万分之一电子分析天平(Sartorius)；KH-250DB 超声清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司)；TGL-16C台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；IKA VortexGenius 3 涡旋仪(莱贝科学仪器有限公司)；DW-40L262 低温保存冰箱(青岛海尔特种电器有限责任公司)。

1.2 药品与试剂

野漆树苷样品(本实验室自制，纯度大于98%)；水：哇哈哈纯净水；甲醇(色谱纯，Fisher公司)；其它试剂均为分析纯。

图1 野漆树苷的化学结构式

1.3 动物

雄性SD 大鼠6只，体重(250±10)g，购于南京青龙山实验动物中心，许可证号SCXK (苏)2012-0004；在(22±2)℃ 环境饲养，自由摄食，饮水。

1.4 色谱与质谱条件

色谱条件：Thermo Hypersil GOLD 色谱柱 (100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；柱温30 ℃；流动相：A 为甲醇，B 为水溶液，梯度洗脱程序：0～20 min，A (45%～90%)，20～25 min，A (90%～90%)，25～25.1 min，A (90%～45%)，25.1～30 min，A (45%)；流速：0.3 mL/min；进样量：1 μL。

质谱条件：AB Triple TOF 5600 四极杆飞行时间质谱仪采用电喷雾离子化 (ESI) 源，喷雾电压 (IS)：-4 500 V，离子化温度 (TEM)：600 ℃；雾化气 (GS1)：60 kPa，辅助加热 (GS2)：60 kPa；气帘气 (CUR)：35 kPa；碰撞气 (CAD)：Medium；扫描模式: Negative。一级质谱采集范围为m/z100～1 000，累积时间250 ms，二级质谱采集范围为m/z100～1000，累积时间100 ms，碰撞能量 (CE): -35 V；碰撞能量叠加 (CES):15。

1.5 样品的采集和处理

将6只大鼠置于代谢笼中，禁食12 h，不禁水，收集空白尿液和粪便。然后每只大鼠灌胃野漆树苷(剂量为96 mg/kg)，收集给药后24 h内的尿液和粪便。取尿液0.5 ml，加甲醇1 mL，涡旋30 s，12 000 r/min，冷冻离心10 min (4 ℃),取上清液进行LC-MS/MS分析。粪便自然晾干，研碎，取粪样0.5 g，加50%甲醇10 mL超声提取30 min，即得粪便匀浆。取一定量匀浆12 000 r/min冷冻离心2次，每次10 min (4 ℃), 取上清液进行LC-MS/MS分析。

2 结 果

2.1 野漆树苷的色谱行为

由于生物样品中存在的内源性物质较多，所以我们不仅分开代谢产物和内源性物质，而且还需要使各代谢产物之间尽可能的分离。通过对流动相条件的优化，在本实验确定的液相条件下，野漆树苷和芹菜素的液相色谱保留时间分别为1.583 min和4.461 min，其色谱图见图2。

2.2 野漆树苷的质谱行为

在负离子检测方式下，获得野漆树苷的[M-H]-准分子离子峰 (m/z577) 和芹菜素的[M-H]-准分子离子峰 (m/z269)，碰撞诱导解离 (CID) 分析该准分子离子，获得二级质谱图，见图2,野漆树苷的主要碎片离子为m/z269,为野漆树苷脱去一分子新橙皮糖产生的碎片离子，也是芹菜素的特征离子峰。芹菜素的主要碎片离子为m/z225、151、117，其中m/z151和m/z117分别为芹菜素C环C1-C2和C3-C4键断裂的碎片离子形成的。

图2 野漆树苷(A)和芹菜素(B)的总提取离子流色谱图 和二级质谱图

2.3 大鼠体内代谢产物结构解析

对大鼠的尿样和粪样进行LC-MS/MS分析。相同检测条件下，给药后的尿样和粪样与给药前空白尿样和粪样比较，发现与野漆树苷相关的化合物的准分子离子峰，分别为m/z269、703、703及271，各化合物保留时间分别为4.461、2.186、2.780及3.041 min，总离子流色谱图见图3,提取离子流色谱图见图4。野漆树苷在大鼠体内可能的代谢产物的色谱质谱相关信息见表1，大鼠体内可能的代谢途径及代谢物的鉴定过程见图5。

图3 大鼠灌胃野漆树苷后体内代谢产物的色谱质谱图

图4 大鼠灌胃野漆树苷后体内野漆树苷及其代谢产物的提取离子流色谱图

M0：在m/z577的提取离子流色谱图中，尿样和粪样中均检测到1个色谱峰，保留时间为1.583 min,其色谱峰与野漆树苷标准品的保留时间一致，EPI质谱图与野漆树苷标准品有相同的碎片离子，所以判断1.583 min色谱峰为野漆树苷。野漆树苷在大鼠尿样和粪样中均检测到，可能为原型药物野漆树苷，也可能为原性药物经代谢后再结合新橙皮糖产生的Ⅱ相代谢产物，其化学结构与原型野漆树苷相同。

M1：在m/z269的提取离子流色谱图中，可以检测到1个与原型药相关的色谱峰，保留时间为4.464 min，命名为M1，主要碎片离子为m/z225、151和117。将M1与芹菜素标准品进行比对分析，发现其色谱信息和质谱信息均与芹菜素标准品相同，鉴定M1为代谢产物芹菜素。

M2：在m/z703的提取离子流色谱图中，可以检测到2个与原型药相关的色谱峰，保留时间分别为2.186 min和2.780 min，命名为M2-1和M2-2。

M2-1的保留时间为2.186 min，其在质谱中为[M+HCOOH-H]-峰，主要碎片为m/z597、395、269、231、117。M2和M1相比多80和46 (HCOOH特征峰)，其中碎片离子m/z269与M0的碎片离子相同，由于二级质谱中硫酸化结合物的主要质谱裂解规律是产生脱去80的碎片离子，因此推测其可能为野漆树苷 (M0) 的硫酸化结合物，结合位点可能为A环的C5位或B环的C4位羟基，其中m/z117为C环裂解后的B环部分，m/z231为C环裂解后的A环部分，所以确定其结合位点发生在A环C5位羟基。

M2-2与M2-1相比，其保留时间不同，为2.780 min，但准分子离子峰及部分碎片离子m/z577、269相同，可推测其也可能为野漆树苷 (M0) 的硫酸化结合物。其中m/z151为C环裂解后的A部分，m/z197为C环裂解后的B环部分，因此确定其结合位点发生在B环C4位羟基。

M3：在m/z271的提取离子流色谱图中，可以检测到1个与原型药相关的色谱峰，保留时间为3.041 min，命名为M3，主要碎片离子为m/z177、151、119，与芹菜素 (M1) 的碎片离子相似，其中m/z151为B环裂解后的A环部分，m/z119比芹菜素的B环裂解后的C环部分多2，推测可能是芹菜素加上2H的代谢产物，推测加氢位点为C2-C3。

表1 大鼠灌胃野漆树苷后体内代谢产物的色谱质谱信息

图5 野漆树苷在大鼠体内的代谢途径

3 讨 论

药物的大部分代谢产物的结构与原型药物相近，并且含有原型药物的特征质谱裂解碎片或中性丢失，因此可通过特征碎片离子、特征中性丢失或者特征碎片离子间质量差推断代谢产物结构[7]。本研究通过 LC-MS/MS 初步分析鉴定了灌胃给药后，野漆树苷在大鼠粪便及尿液中代谢产物，其中2个Ⅰ相代谢产物 (M1和M3)，2个Ⅱ相代谢产物 (M2-1和M2-2)。对于代谢产物结构的鉴定与确证，标准品对照法是一种比较准确且成熟的方法，该方法具有简便、快速、准确度高等优点，目前已有很多研究证明了该方法的合理性与可靠性[8-9]。综合代谢产物的色谱信息与质谱信息，发现芹菜素标准品和代谢产物M1的色谱信息及质谱信息完全相同，由此可见，代谢产物M1为芹菜素，同时也证明了该代谢产物结构的合理性与正确性。

黄酮类化合物主要在体内的肠道和肝脏代谢，其水解反应较多发生在肠道[10]，有研究表明在肠粘膜乳糖酶根皮苷水解酶的作用下黄酮糖苷可水解成苷元[11]。本研究表明野漆树苷在大鼠体内主要生成脱新橙皮糖基的苷元芹菜素，而一部分芹菜素又在微粒体酶催化下，生成柚皮素。大鼠灌胃野漆树苷经肠粘膜吸收，可在硫酸转移酶等Ⅱ相酶作用下，发生Ⅱ相结合反应，生成硫酸结合物。

[1] 高书良, 卢元元, 安利娟, 等. 野漆树苷对雷公藤甲素诱导肝损伤的保护作用[J]. 中药药理与临床, 2012, 28(6): 18-20.

[2] 杨小玲, 王燕平, 谢宁, 等. 野漆树苷的提取方法及其制备药物用途[P]. 中国专利: CN102633850A, 2010-08-15.

[3] Davide B, Ersilia B, Corrado C, et al. Flavonoid composition and antioxidant activity of juices from Chinotto(Citrus-myrtifolia Raf.) fruits at different ripening stages[J]. Agric and Food Chem, 2010, 58(5): 3031-3036.

[4] Rajkumar S, JebanesanA. Bioactivity of flavonoid compounds from Poncirus trifoliataL. (Family:Rutaceae) against the dengue vector, Aedes aegypti L. (Diptera:Culicidae) [J]. Parasitol Res, 2008, 104(6): 19-25.

[5] Yerra K R, Lee M J, Chen K, et al. Insulin-mimetic action of rhoifolin and cosmosiin isolated from Citrus grandis (L.) Osbeck leaves: enhanced adiponectin secretion and insulin receptor phosphorylation in 3 T3 -L1 cells[J]. Evidence-Based Compl Altern Med, 2011, 18(1): 1-9.

[6] 国家药典委员会.中国药典:一部[S]. 北京: 化学工业出版社, 2010: 28.

[7] 董世奇, 樊慧蓉, 李全胜, 等. 甘草在大鼠体内的代谢途径研究[J]. 中草药, 2014, 45(17): 2499-2505.

[8] 张薇, 郑枫, 刘文英. BAPTA-AM在体外大鼠血浆中3个代谢产物的结构确证[J]. 中国药科大学学报，2008, 39(2): 151-154.

[9] 谢阳, 赖维, 万苗坚, 等. 荔枝果皮中的美白剂根皮苷的提取、纯化及鉴定[J]. 中国美容医学, 2008, 17(7): 1032-1034.

[10] 何佳珂, 于洋, 陈西敬, 等. 黄酮类化合物的药物代谢研究进展[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(21): 2789-2793.

[11] Graf B, Aeho C, Dolnikowkig G, et al. Rat gastrointestinal tissues metabolize quercetin [J]. J Nutr, 2006, 136(1): 39-44.

Metabolites of Rhoifolin in Ratsinvivoby UPLC-Triple TOF-MS

Liu Jing1, Wang Qing1, Xin Guizhong1, Liu Lifang1*, Liu Jianqun2*

(1.The State Key Laboratory of Natural Medicines Components and Pharmcodynamics, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2.Key Laboratory of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Traditional Medicine, Nanchang 330004, China)

Objective: In vivo study of the metabolites of rhoifolin (RH) in rats. Methods: An UPLC-Triple TOF-MS method was established and applied to identify the metabolites of RH in urine and feces after ig administration of RH (96 mg/kg) to rats. Results: A total of four metabolites were identified in urine and feces of rats. The structures of these metabolites were calculated by a comprehensive analysis of precursor and fragment ions of possible metabolites. Conclusion: These results would provide support for seeking plasma metabolites, discovering bioactive constituents, and clarifying metabolic pathways of RH.

rhoifolin; the ratsinvivo; metabolites; UPLC-Triple TOF-MS

2014-12-28

江苏高校优势学科建设工程资助项目及国家自然科学基金资助项目(30960495)。

刘敬(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：现代中药分析。E-mail: liusijiatong@163.com

*通讯作者：刘丽芳，女，博士，教授，博士生导师，主要从事中药分析方法研究。E-mail: liulifang69@126.com 刘建群,男,博士,教授,研究方向为中药活性成分及质量评价。E-mail: liu5308@sina.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.05.006

R284.1

A

1006-9690(2015)05-0023-05