猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析

屈 锋 陕西省泾阳县动物卫生监督所 713700

王敏杰 陕西省榆林市榆阳区青云镇畜牧兽医工作站 719000

猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析

屈 锋 陕西省泾阳县动物卫生监督所 713700

王敏杰 陕西省榆林市榆阳区青云镇畜牧兽医工作站 719000

我国多个省份的大规模养猪场都出现过新生仔猪神经疾病和死亡的案例，为了确定是否猪伪狂犬病病毒的感染所致，本次研究选取我国多个省份的13个PR免疫猪场送检的156份病毒样品，采用PCR方法对死亡仔猪脑组织中扩增PRV的gE基因，进行PRV病毒的分离鉴定和血清中和实验及gE基因序列分析。将疑似PR病毒发病猪的脑部组织进行匀浆，提取其DNA进行PRV检测，发现各个猪场都存在病毒感染。结论：依据本次实验结果进行推测，当下各个猪场流行的PRV病毒可能存在一定的抗原变异。

猪伪狂犬病病毒；新流行株；分离鉴定；抗原差异性分析

在现代临床研究治疗中，由PR病毒所引起的猪急性传染病就是猪伪狂犬病，PRV病毒会导致不同年龄段的猪被感染，其中又以哺乳猪仔和妊娠期母猪感染最为严重，致使哺乳猪仔出现麻痹、神经疾病、器官衰竭直至死亡，致使妊娠母猪流产、产木乃伊胎、死胎，此类感染PRV病毒的死亡率达到100%。对于PRV病毒病，我国大型养猪场均采用PRV基因缺失疫苗进行预防和治疗，大体上取得了较好的效果。但是从2011年以来，很多采用PRV基因缺失疫苗进行预防和治疗的大型养猪场都出现了疑似PR病毒，临床表现为母猪产死胎、弱仔，哺乳猪仔出现麻痹、神经疾病及死亡。本次研究选取我国多个省份的13个PR免疫猪场送检的156份病毒样品进行PRV病毒的分离鉴定和血清中和实验及gE基因序列分析，结果显示，这些猪场所流行的PRV病毒拥有某种程度的抗原变异。

1 资料与方法

（1）临床资料。选取我国多个省份的13个PR免疫猪场送检的156份病毒样品进行PRV病毒的分离鉴定和血清中和实验及gE基因序列分析，PRV经典强毒双城株和PRV疫苗株都在本院实验室进行保存。对来自我国河南、内蒙古、吉林、黑龙江、江苏等多个省区的13个PR免疫猪场送检的怀疑是PR的猪脑组织156份病毒样品，选取适量猪脑组织进行匀浆，依据临床操作准则，一部分匀浆液体用于病毒的分离鉴定，一部分用于提取病毒基因组的DNA进行PCR鉴定。

（2）实验对象和细胞。实验猪和小鼠购买自兽医研究所，Vero细胞在本实验室进行保存。

（3）引物的设计和合成。依据GenBank中所登记的PRV基因序列分别设计用来gE全基因扩增和序列分析的引物和扩增部分的gE基因的检测引物。

（4）病毒基因组的提取和PCR扩增以及病毒的分离。病毒基因组的提取和PCR扩增参考文献[1]所描述的方法进行临床操作。病毒的分离是将PCR鉴定为阳性的脑组织匀浆，采用过滤器进行过滤和除菌以后，取接种的Vero单层细胞，进行孵化孕育1小时后，更换含有2%的胎牛血清的DMEM培养液体，观察细胞的病变，等待70%左右的细胞出现CPE时收毒，进行冻融一次以后，连续在Vero细胞中传代扩大培养。

（5）电镜观察病毒粒子。选取Vero细胞培养的病毒液体，采用2%的磷钨酸负染，在电镜下观察病毒的粒子形态。

（6）小鼠的感染实验。选取6～8周的55只小鼠，25只接种10×倍比稀释的PRV-S强毒株，25只接种10×倍比稀释的F5代分离株，经过腹股沟皮下接种0.1mL，对另外5只小鼠注射等体积的DMEM培养液体来作为阴性对照。观察小鼠的临床症状和死亡状况，依据Reed Muench方法进行计算其LD50。

（7）病毒的中和实验。对新分离的病毒接种猪血清和疫苗株Bartha k61接种猪血清，采用固定病毒稀释血清方法测定两株病毒的中和抗体。

2 结果

病毒资料检测。将疑似PR病毒的发病猪的脑部组织进行匀浆，提取其DNA进行PRV检测，发现各个猪场都存在病毒感染。

病毒的分离及鉴定。将少部分猪脑脑组织匀浆液体过滤除菌接种Vero细胞，48小时可以观察到网状的细胞病变。进行PCR鉴定，可以扩增到预期的大小片段，采用猪圆环病毒、猪繁殖、猪瘟和呼吸综合征病毒特异性物扩增，都呈现阴性反应。电镜检测，观察到病毒的粒子呈圆形，临床体征有实心和中心，分为没有囊膜和有囊膜两种。

gE基因序列的分析。最近分离的PRV都处于相对独立的分支中，和以往分离的病毒株亲缘关系比较远。

小鼠的感染实验。小鼠接种的PRV-S强毒株和F5代分离株都出现了PR临床症状，发病白鼠撕咬接种的部位，致使局部皮肤出血、皮毛脱落、撕咬肢体，病毒接种量达到103.0～106.0的TCID50的小鼠72小时后死亡，F5代分离株小鼠的 LD50为 103.37 TCID50，PRV-S小鼠的LD50为103.83 TCID50，注射DMEM培养液体的对照组小鼠没有临床症状。

血清交叉中和实验。疫苗株Bartha k61接种猪血清产生的中和抗体水平和病毒接种猪血清相比比较低，可以50%中和自身病毒的血清稀释度都在1∶20～1∶40。对于分离病毒接种猪血清的中和能力更加低，分离病毒接种猪感染2周就可以产生高水平的中和抗体，50%中和病毒的血清稀释度都在1∶80以上，对两种病毒的中和能力都比较。

3 讨论

危害养猪业的严重传染病就包括猪伪狂犬病，对猪伪狂犬病的预防主要依靠基因缺失疫苗的接种[2]。

采用微量中和实验进行血清学进行分析，Bartha k61接种猪血清所产生的中和病毒接种猪血清产生的中和抗体水平比较低，对新分离的病毒接种猪血清产生的抗体水平较高，表明PR当下流行的病毒株和疫苗株之间在抗原性上存在一定的差异。

[1]彭金美，王瑜，田志军，等．带BAC质粒的重组伪狂犬病病毒的构建及其体外生长特性研究[J]．中国预防兽医学报，2010，31 (1)：10-15．

[2]童光志，周艳君，郝晓芳，等．高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析 [J]．中国预防兽医学报，2011，29(5)：323-327．