氧化应激对围产期奶牛乳房炎的影响及其调控机制

马燕芬 宋利文 高 民* 王丽芳

(1.内蒙古农牧业科学院动物营养与饲料研究所，内蒙古自治区草食动物营养科学重点实验室，呼和浩特 010031;2.内蒙古农牧业科学院资源环境与检测技术研究所，呼和浩特 010031)

奶牛乳房炎是奶牛生产中最为常见的一种疾病，不仅严重危害奶牛生产性能，而且存在治疗周期长、成本高等特点，同时间接影响着人类的健康。探究奶牛乳房炎发病诱因，主要与饲粮营养物质摄入失衡、机体内激素分泌失调、乳房机械性损伤、饲养卫生条件不良、病原微生物感染等因素密切相关。目前大部分文献对奶牛乳房炎发病机理可总结为:病原微生物通过入侵奶牛机体使乳腺感染，进而引起乳房内产生炎症等一系列过程［1-2］。在由病原微生物引起的奶牛乳房炎中，最为常见的致病菌主要有革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，其中革兰氏阴性菌主要为大肠杆菌，其主要的致病物质为脂蛋白多糖(lipopolysaccharide，LPS);革兰氏阳性菌主要包括葡萄球菌和链球菌等。目前已对由大肠杆菌，尤其是对LPS诱导的急性乳房炎的发生、发展、转归的分子机制有了较为深入的研究。其具体发病机制为“Toll样受体4(Toll-like receptor-4，TLR-4)”信号通路，它是目前发现的最为重要的炎性通路之一，与许多疾病的发生及发展过程相关，其所介导的下游炎症信号的级联式反应往往会使疾病朝不良的方向转归。TLR-4通过识别病原相关分子模式的特有抗原成分而进行信号识别和传导，LPS是TLR-4的最重要的配体。LPS通过LPS-脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)-sCD14(sCD14蛋白)三联复合物作用于 Toll样受体(TLR)并激活骨髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，活化的 MyD88 可结合白细胞介素-1受体相关激酶(interleukon-1 receptor associated kinase，IRAK)，然后作用于肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNFR-associated factor 6，TRAF6)，进一步激活主要的下游信号通路丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核因子-κB(NF-κB)。其中 MAPK 信号通路的激活主要参与多种细胞功能的调控，尤其是在细胞增殖、分化与凋亡中起着关键作用，而NF-κB信号通路的激活主要引起细胞的增殖、炎症、免疫调节等反应［3］。目前对其由金黄色葡萄球菌、链球菌等革兰氏阳性菌引起的奶牛乳房炎的发病机制及转归过程并不是十分清楚。

围产期是奶牛整个泌乳周期中最为至关重要的一个时期，围产期奶牛在经历了“干奶—产犊—泌乳”一系列过程，极易使乳腺产生氧化损伤，诱发并加重乳房炎、子宫内膜炎等代谢性疾病，目前对其确切机制尚不清楚。近年来的研究发现，氧化应激在诱导围产期奶牛乳腺组织产生氧化损伤和抗氧化机能降低方面发挥关键作用，持续的氧化应激可通过产生大量的氧自由基来攻击细胞，诱导脂质过氧化，并引起细胞膜结构和功能发生改变，造成生产性能下降、机体免疫功能和炎症应答能力下降，对疾病的易感性增强，使乳房炎、子宫炎、酮病、脂肪肝、真胃变位、胎衣滞留等代谢病发生率增加［4］，并导致乳腺分泌的乳汁异常。围产期和泌乳高峰期奶牛乳腺比泌乳中后期奶牛更易受到氧化应激攻击而产生损伤，但其具体机制并不清楚。

核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)是近年来新发现的一种核转录因子，以Nrf2-抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)信号通路调控下游一系列Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因［血红素氧合酶-1(HO-1)、还原性辅酶Ⅱ醌氧化还原酶1(NQO-1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽转硫酶(glutathione S-transferase，GSTs)］的表达，是细胞对抗外源性刺激和氧化损伤的主要通路［5］。Nrf2-ARE信号通路及其下游基因已经被证实在多种细胞、组织和器官抗氧化损伤中发挥重要作用，是迄今为止最为重要的抗氧化应激通路。但目前有关通过调控Nrf2-ARE信号通路来减缓氧化应激对奶牛乳腺产生氧化损伤方面的研究还未见报道。本文主要对氧化应激、氧化应激与围产期奶牛乳房炎、机体氧化应激的自我调控机制进行综述，以其为奶牛在围产期内能够维持机体健康、发挥正常的泌乳功能和提高生产性能提供理论参考。

1 氧化应激

氧化应激是指机体在遭受体内外各种有害刺激时，氧化系统和抗氧化系统失衡，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)的产生量大大超过机体的清除能力，抗氧化系统不能及时清除过多的自由基而造成的［6］。机体在正常生理状态下，自由基是机体有效的防御系统，处于不断产生与清除的动态平衡之中，对机体自身健康发挥着积极的免疫功能作用。如可增强白细胞的吞噬功能，提高杀菌效果;促进前列腺素的合成;参与胶原蛋白的合成;参与肝脏的解毒作用;参与凝血酶的合成等功能作用。因此，机体自由基如若不能维持在一定水平时，就会对机体生命活动产生不利的影响。但是当机体自由基产生过多或者清除过慢，这些多余的自由基就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。目前已被证实，氧化应激参与了多种疾病的发生，在人体方面主要包括动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、眼部疾病、神经退行性疾病及癌症等［6］;在奶牛等动物方面主要包括乳房炎、胎衣不下、真胃移位、子宫内膜炎等。其中，机体中的生物大分子如脂类、蛋白质和DNA是最容易受到氧化应激的损害。

一般在生理状态下，细胞在代谢过程中可产生少量处于自由状态的活性氧，包括氧自由基和非氧自由基，但机体同时也存在着抗氧化物质，可以及时清除活性氧，使活性氧的生成和降解处于动态平衡状态，因而细胞在正常代谢过程中产生的活性氧对机体并无有害影响。机体内的这些抗氧化物质主要包括低分子自由基清除剂和酶性自由基清除剂，其中低分子自由基清除剂包括细胞脂质部分的清除剂如维生素C、维生素E、还原型谷胱甘肽等，酶性自由基清除剂包括SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、GSTs和CAT等。但在病理状态时，如缺氧、缺血或产生炎症时，由于活性氧生成过多或抗氧化物质含量减少和(或)活性降低，导致机体内蓄积过多的活性氧，此时，蓄积的过多的活性氧就会对机体细胞产生多种毒性作用，并损伤机体组织，导致机体呈现病理状态。大量的活性氧破坏了机体内部的氧化/抗氧化平衡状态，引发机体产生氧化应激，氧化应激的毒性效应产生了大量氧化中间产物如过氧化氢、超氧阴离子、羟基等，这些中间产物不仅对各种细胞器和细胞膜产生攻击，还会对蛋白质、膜磷脂、核酸等大分子物质产生破坏作用，进而破坏机体组织和细胞的结构和功能，最终导致细胞坏死或凋亡。

2 氧化应激对围产期奶牛乳房炎的影响

奶牛围产期是指产前3周至产后3周，是奶牛整个泌乳周期中至关重要的一个时期。奶牛在围产期由于受饲粮营养成分的变化，能量需要增加而干物质采食量下降造成的能量负平衡(NEB)以及分娩应激等的影响，致使机体抵抗力下降，易发生一些与分娩有密切关联的代谢性疾病如乳房炎、子宫内膜炎、胎衣不下、难产、产后瘫痪、子宫脱出、酮病等。这些疾病的发生常常会降低奶牛的繁殖性能、生产性能和免疫机能，甚至被迫淘汰，给奶牛场和养殖户造成极为严重的经济损失。

近年来，大量的研究表明围产期奶牛极易受到氧化应激而造成损伤［7-9］。奶牛生产中，不仅仅是围产期奶牛乳腺，泌乳阶段奶牛乳腺也易受到氧化应激的损伤而诱发乳房炎等代谢性疾病。一方面，由于奶牛机体能量需要和分娩后大量泌乳所需要的能量远远超过干物质采食量所能提供的能量，造成能量负平衡，能量负平衡迫使机体脂质大量动员，脂质被氧化并产生大量的活性氧，这些过量的活性氧蓄积于细胞内，如果不能及时清除，很容易引起奶牛机体产生氧化应激［8-10］。另一方面，由于围产期奶牛从妊娠到泌乳要经历巨大的代谢和生理适应性，临产阶段活性氧生成增加和抗氧化防御能力之间的不平衡极易使奶牛处于氧化应激状态。产生的氧化应激极易诱导机体产生脂质过氧化，引起细胞膜结构和功能的改变，造成生产性能下降，机体免疫机能和炎症应答能力下降，对疾病的易感性增强［4，11］。而处于泌乳后期的奶牛由于没有代谢负担而受氧化应激的影响非常小［8］。奶牛围产期内尤其是肝脏和乳腺的代谢活动增强，代谢活动的增强伴随着氧自由基类产物的增加［12］，其中乳腺产生氧化应激最严重的阶段是泌乳开始阶段［13］。

在正常生理情况下，奶牛乳腺组织中脂质过氧化物和氧自由基的产生与清除之间保持动态平衡，不易受到氧化损伤，且低浓度的氧自由基在正常的细胞代谢和信号转导中充当介质具有重要的作用。但在泌乳期间尤其是高产奶牛由于乳腺上皮细胞的代谢旺盛，一方面是过多的营养素在消化代谢过程中引起快速的脂质代谢，增加脂肪组织分泌一些调控脂质代谢和氧化应激的因子，很容易产生氧化损伤;另一方面较高浓度的氧自由基是有害的，活性氧不但能够引起乳腺损伤，在围产期间，与白细胞侵润和炎性反应介质释放密切相关的活性氧还会进一步加重乳腺损伤。

自由基的清除和调整能够增强内源性抗氧化系统的作用，从而对抗乳房炎乳腺产生的损伤。近年来研究发现，Nrf2和它的胞质接头蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)是细胞抗氧化反应的中枢调节物质，Nrf2转录因子通过调节细胞抗氧化防御机制对于预防胃肠道和乳腺等方面的疾病十分关键［6］。

3 机体氧化应激的自我调控机制

动物机体主要通过自身的抗氧化防御系统来维持自由基的产生速率与消除速率之间的动态平衡，抵御氧化应激对其所造成的损伤。细胞外的刺激主要是通过各种细胞信号通路来完成信号转移的，而机体对于刺激的反应也往往是通过各种信号传导通路来完成的。Nrf2是调控细胞对抗外源性有害物质和氧化损伤的关键转录因子，若Nrf2在激活时产生障碍或缺失都将会引起细胞对应激的敏感性增高，导致炎症修复进程延长、细胞凋亡、化学促癌等一系列病理过程的发生。

3.1 Nrf2 基本结构

Nrf2近年来被鉴定为Ⅱ相代谢酶基因上游启动子区域的ARE的主要调控物质，协同调节一组编码药物代谢酶和抗氧化蛋白［14］。Nrf2最初是在结合到β球蛋白基因调控区的蛋白中被鉴定出来的［15］。Nrf2 属于 CNC(Cap-‘N’-Collar)转录因子家族成员，含有6个高度保守的功能区，分别被命名为Nehl～Neh6(Nrf2-ECH同源物)。C-末端的Nehl结构域中有一个高度保守的碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构与小Maf蛋白形成的异二聚体，是Nrf2识别ARE并与之结合，启动目标基因转录的重要前提［16］。N-末端有高度保守的Neh2结构域和2个激活区Neh4、Neh5。Neh2区是 Nrf2与胞浆蛋白 Keap1结合区。而 Neh4和 Neh5是cAMP反应结合蛋白(CREB)、结合蛋白(CBP)的结合部位，促使CBP协同参与对Nrf2目标基因转录活性的激活。Neh6结构域是氧化还原非敏感区，对氧化应激状态下Nrf2的降解有重要的作用。Neh3结构域位于梭基端，具有高度保守性，Neh3与染色质域解旋酶DNA结合蛋白6(chromo-ATPase/heliease DNA binding protein 6，CHD6)结合后，上调Nrf2目标基因的表达［17］。

3.2 Nrf2-ARE信号通路及发挥抗氧化应激作用的机制

Nrf2-ARE信号通路下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因均在抗氧化应激中发挥关键作用，抗氧化基因主 要 包 括 HO-1、GSH-Px、GSTs、CAT、SOD、GCLC、GCLM 及 NQO1［18］。在氧化应激条件下，Nrf2被磷酸化将使蛋白激酶对Nrf2降解作用减弱。在生理状态下，Nrf2的Neh2区与Keapl相结合并成为蛋白激酶作用的目标而处于降解状态;氧化应激时degrons区被磷酸化后构象发生改变，使蛋白激酶对Nrf2的识别能力减弱，增加Nrf2的含量和稳定性，促进其入核并启动下游基因的转录。目前已证实，多种蛋白激酶如蛋白激酶C(PKC)、MAPK和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)等均参与了 Nrf2-ARE信号通路的激活及其依赖的基因表达调控过程［19-21］，且PKC家族中的众多成员均可使 Nrf2磷酸化，PKC磷酸化Nrf2的作用位点是丝氨酸-40(Ser-40)。

Nrf2是细胞调节抗氧化应激反应的最重要转录因子，Nrf2的激活是其发挥抗氧化作用的前提条件，而Nrf2与Keapl的解离是其完成对目标基因转录调控的第1步。在生理状态下，Nrf2与胞浆伴侣蛋白Keapl相结合，处于相对抑制的状态并被锚定在胞浆中，避免引起细胞对应激源的敏感性升高;但当细胞受到氧化剂或亲电试剂作用时，Keapl上的2个半胱氨酸位点C273和C288被同时修饰，致使Keapl与Nrf2的偶联及泛素化酶对Nrf2的泛素化作用减弱或消除，致使Nrf2与Keapl解偶联后，激活 Nrf2使其转入核内［22-23］，与核内的Mar蛋白结合形成异二聚体后识别并结合ARE，从而启动下游抗氧化基因及一系列Ⅱ相解毒酶的转录，发挥强大的抗氧化作用［24］。在Ⅱ相解毒酶诱导剂刺激后蛋白激酶如P38 MAPK、胰腺内质网激酶(PERK)及PKC等被激活，进而致使Nrf2以磷酸化方式活化，Nrf2在细胞核含量大幅度增高，引起ARE的表达增加，从而启动抗氧化酶的表达［25］。若Nrf2存在激活障碍或缺失，下游抗氧化酶表达量降低，无法对抗氧化应激源对细胞的毒性，则会导致细胞功能障碍、凋亡或坏死。

3.3 Nrf2-ARE信号通路在抗氧化应激相关疾病中的作用

氧自由基介导的氧化应激广泛参与众多疾病的发生、发展的病理生理过程。研究表明，急慢性氧化应激与炎症［26］、衰老［27］、神经系统疾病［28］、肿瘤［29］等多种氧化应激相关疾病的发生、发展过程密切相关。如何有效地清除机体产生的过量蓄积的氧自由基一直是医学领域研究的热点。近年来的研究发现，Nrf2-ARE信号通路是迄今为止最为重要的抗氧化应激信号通路，通过调控该信号通路可为实施抗氧化治疗开辟新的途径。

在奶牛代谢病方面的研究也已证实氧化应激参与了奶牛乳房炎、胎衣不下、真胃移位、子宫内膜炎等代谢病的发生、发展过程，且调控Nrf2-ARE信号通路可能对围产期奶牛由于氧化应激诱导的乳腺氧化损伤以及抗氧化功能降低有预防和治疗作用。但到目前为止，关于Nrf2-ARE信号通路与围产期奶牛乳腺产生氧化损伤方面的研究还未见相关报道，对其作用的具体机制还不清楚，有待于对这方面开展深入研究。

4 小结

综上所述，以奶牛乳房炎为主的高发病率的围产期奶牛代谢性疾病严重地影响了奶牛机体的健康，导致奶牛繁殖性能、生产性能和免疫机能下降，直接影响奶牛的养殖效益。奶牛乳房炎发病机制比较复杂。目前研究发现，氧化应激参与了奶牛乳房炎等代谢病的发生、发展过程，有关氧化应激对奶牛的危害及其防治措施，吴永霞等［30］对其作了详细的综述。但到目前为止，关于Nrf2-ARE抗氧化应激信号通路与乳房炎发病关系的研究较少，而通过调控Nrf2-ARE信号通路可为我们对奶牛乳腺损伤的治疗提供一种新的思路和治疗手段。

［1］ 王建军，税丽.奶牛乳房炎致病机理研究进展［J］.中国畜牧兽医，2009，36(12):100-103.

［2］ 李方华，冯士彬，李孝文.奶牛乳房炎的发病机理及防治研究进展［J］.中国动物保健，2008(8):40-43.

［3］ GUO J S，FRIEDMAN S L.Toll-like receptor 4 signaling in liver injury and hepatic fibrogenesis［J］.Fibrogenesis ＆ Tissue Repair，2010，3:1-19.

［4］ SORDILLO L M.Factors affecting mammary gland immunity and mastitis susceptibility［J］.Livestock Production Science，2005，98(1/2):89-99.

［5］ RAMOS-GOMEZ M，KWAK M K，DOLAN P M，et al.Sensitivity to carcinogenesis is increased and chemoprotective efficacy of enzyme inducers is lost in nrf2 transcription factor-deficient mice［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98(6):3410-3415.

［6］ 童海达，王佳茗，宋英.Keap1-Nrf2-ARE在机体氧化应激损伤中的防御作用［J］.癌变·畸变·突变，2013，25(1):71-75.

［7］ BOUWSTRA R J，GOSELINK R M A，DOBBELAAR P，et al.The relationship between oxidative damage and vitamin E concentration in blood，milk，and liver tissue from vitamin E supplemented and nonsupplemented periparturient heifers［J］.Journal of Dairy Science，2008，91(3):977-987.

［8］ CASTILLO C，HERNANDEZ J，BRAVO A，et al.Oxidative status during late pregnancy and early lactation in dairy cows［J］.The Veterinary Journal，2005，169(2):286-292.

［9］ 王艳明.日粮脂肪和能量水平对奶牛氧化应激、生产性能的影响及抗氧化剂添加效果研究［D］.博士学位论文.杭州:浙江大学，2010.

［10］ BERNABUCCI U，RONCHI B，LACETERA N，et al.Influence of body condition score on relationships between metabolic status and oxidative stress in Periparturient dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(6):2017-2026.

［11］ LÖHRKE B，VIERGUTZ T，KANITZ W，et al.Short communication:hydroperoxides in circulating lipids from dairy cows:implications for bioactivity of endogenous-oxidized lipids［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(5):1708-1710.

［12］ LÖHRKE B，VIERGUTZ T，KANITZ W，et al.Relationship between oxidant stress and milk productivity in dairy cows［J］.Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift，2005，118(7/8):265-269.

［13］ PICCIONE G，BORRUSO M，GIANNETTO C，et al.Assessment of oxidative stress in dry and lactating cows［J］.Acta Agriculturae Scandinavica，Section A:Animal Science，2007，57(2):101-104.

［14］ GUVEN A，TUNC T，TOPAL T，et al.Alpha-lipoic acid and ebselen prevent ischemia/reperfusion injury in the rat intestine［J］.Surgery Today，2008，38(11):1029-1035.

［15］ ZIMMERMAN B J，GRANGER D N.Mechanisms of reperfusion injury［J］.The American Journal of the Medical Sciences，1994，307(4):284-292.

［16］ FREEMAN B A，CRAPO JD.Biology of disease:free radicals and tissue injury［J］.Laboratory Investigation，1982，47(5):412-426.

［17］ JOHNSON J A，JOHNSON D A，KRAFT A D，et al.The Nrf2-ARE pathway:an indicator and modulator of oxidative stress in neurodegeneration［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2008，1147:61-69.

［18］ KWAK M K，WAKABAYASHI N，ITOH K，et al.Modulation of gene expression by cancer chemopreventive dithiolethiones through the Keap1-Nrf2 pathway identification of novel gene clusters for cell survival［J］.The Journal of Biological Chemistry，2003，278(10):8135-8145.

［19］ KONG A N T，OWUOR E，YU R，et al.Induction of xenobiotic enzymes by the MAP kinase pathway and the antioxidant or electrophile response element(ARE/EpRE)［J］.Drug Metabolism Reviews，2001，33(3/4):255-271.

［20］ LEE J S，SURH Y J.Nrf2 as a novel molecular target for chemoprevention［J］.Cancer Letters，2005，224(2):171-184.

［21］ KANG K W，LEE S J，PARK J W，et al.Phosphatidylinositol 3-kinase regulates nuclear translocation of NF-E2-related factor 2 through actin rearrangement in response to oxidative stress［J］.Molecular Pharmacology，2002，62(5):1001-1010.

［22］ CHO H Y，JEDLICKA A E，REDDY S P M，et al.Role of NRF2 in protection against hyperoxic lung injury in mice［J］.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology，2002，26(2):175-182.

［23］ CHO H Y，JEDLICKA A E，REDDY S P M，et al.Linkage analysis of susceptibility to hyperoxia Nrf2 is a candidate gene［J］.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology，2002，26(1):42-51.

［24］ LEE J M，JOHNSON J A.An important role of Nrf2-ARE pathway in the cellular defense mechanism［J］.Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2004，37(2):139-143.

［25］ CLEMENTS C M，MCNALLY R S，CONTI B J，et al.DJ-1，a cancer-and Parkinson’s disease-associated protein，stabilizes the antioxidant transcriptional master regulator Nrf2［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103(41):15091-15096.

［26］ OSBURN W O，YATESM S，DOLAN PD，et al.Genetic or pharmacologic amplification of nrf2 signaling inhibits acute inflammatory liver injury in mice［J］.Toxicological Sciences，2008，104(1):218-227.

［27］ SHIH P H，YEN G C.Differential expressions of antioxidant status in aging rats:the role of transcriptional factor Nrf2 and MAPK signaling pathway［J］.Biogerontology，2007，8(2):71-80.

［28］ ZAKKAR M，VAN DER HERDIN K，LUONG L A，et al.Activation of Nrf2 in endothelial cells protects arteries from exhibiting a proinflammatory state［J］.Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2009，29(11):1851-1857.

［29］ NIOI P，NGUYEN T.A mutation of Keap1 found in breast cancer impairs its ability to repress Nrf2 activity［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，362(4):816-821.

［30］ 吴永霞，董国忠，贾亚伟.氧化应激对奶牛的危害及其防治［J］.中国饲料，2011(4):32-35.