甘氨酸的免疫调节作用及其分子机制

杜瑞平 张兴夫 高 民* 敖长金

(1.内蒙古农牧业科学院动物营养与饲料研究所，呼和浩特 010031;2.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018)

畜禽良好的健康及生产性能取决于多种因素，包括遗传、饲养、对病原体的接触频繁程度等，然而营养在调节动物对感染性疾病的易感性上起着重要作用。营养不良和疾病感染是世界范围内动物和人类生存、生长、繁殖和健康的主要障碍［1］。这个全球性问题催生了营养免疫学的发展，它阐明了在分子、细胞、组织和机体几个不同层次上营养物质对免疫系统的代谢和功能所发挥的作用。营养物质调控免疫系统运作的能力也是现代动物生产中的一个重要研究热点。特别是蛋白质供应对许多动物包括幼畜和成年动物对疾病的抵抗力的培育很重要。传统意义上的营养需要量概念是基于营养素的缺乏水平而判定的，基于此氨基酸通常被分为必需氨基酸和非必需氨基酸。然而近年来，越来越多的研究证实了一些传统上被认为非必需的氨基酸除了作为蛋白质合成的底物原料，它们还能够通过自身及其代谢产物所具有的生物活性对机体内营养物质代谢(蛋白质代谢、脂代谢、糖代谢等)、神经内分泌调节、基因表达、信号转导、抗氧化应激及免疫功能等产生调控作用，这些调节作用最终可影响到动物的生长发育、生产性能以及健康状况［2］。因此，功能性氨基酸或者条件性氨基酸的概念应运而生并越来越受到理论和生产的重视。目前研究较多的此类氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸等。在免疫应激反应中，氨基酸将发生重分配并主要用于合成参与炎症和免疫反应的蛋白质以及参与免疫细胞增殖和其他免疫反应的重要化合物［3］。因此，在确定人或动物对氨基酸的需要量时，除了考虑其对机体蛋白质合成的作用外，还应考虑其本身重要的生理活性功能［4］。

鉴于氨基酸营养在动物和人类营养中的重要性，明确单个氨基酸在免疫应答中的作用可以帮助制定有效的策略来预防感染性疾病从而促进机体健康［5］。然而，有关这方面潜在的细胞和分子机制研究仅在近十几年来才开始展开［6］。甘氨酸(glycine，Gly)作为自然界中结构最简单的氨基酸，通常在营养学中被归类为非必需氨基酸。然而，甘氨酸除了参与蛋白质和许多重要的代谢性生理分子的合成，还是一种重要的神经递质，在中枢神经系统有着复杂的功能。大量体内和体外研究表明，甘氨酸对诸多动物模型的缺血再灌注(ischaemia-reperfusion，I/R)损伤、休克、氧化应激、细胞膜损伤、器官移植、酒精性肝炎、肝纤维化、关节炎、肿瘤转移及药物中毒等都具有保护作用［7］。近年来的研究发现，甘氨酸还有抗炎和免疫调节作用［8-9］。虽然甘氨酸的轻微缺乏并不会危及生命，但长期、慢性的甘氨酸缺乏可能会导致次优生长、免疫应答功能减弱以及其他对健康和营养代谢不利的影响［10］。

1 甘氨酸概述

甘氨酸又名氨基乙酸，是氨基酸系列中结构最为简单，人体非必需的一种氨基酸，固态呈白色结晶或结晶性粉末，味甜。在分子中同时具有酸性和碱性官能团，在水中可电离，具有很强的亲水性，属于极性氨基酸，而且具有较高的沸点和熔点，通过水溶液酸碱性的调节可以使甘氨酸呈现不同的分子形态。甘氨酸是内源性抗氧化剂还原性谷胱甘肽的组成氨基酸，机体发生严重应激时常外源补充，有时也称为半必需氨基酸。

甘氨酸的合成途径主要包括:丝氨酸合成途径、胆碱合成途径及苏氨酸合成途径。其在体内的吸收通过一系列转运体，最经典吸收途径为与钠(Na)、氢(H)、氯(Cl)的协同转运［11］。甘氨酸的代谢途径有多种，除了用于合成蛋白质，尤其是胶原蛋白和弹性蛋白外，还参与了许多重要的生理性分子的合成，包括嘌呤核苷酸、谷胱甘肽和血红素等［12］。

2 甘氨酸主要生理作用

2.1 抑制性神经递质

甘氨酸是中枢神经系统中介导快速抑制性神经传导的主要元件之一。甘氨酸作为抑制性神经递质的特性最早于1965年提出来的［13］，它被定位在脊髓突触区域。甘氨酸通过结合其位于突触后神经元膜上的甘氨酸受体(GlyR)，使氯离子内流并诱发突触后超极化，来发挥其抑制作用，从而降低了神经元的兴奋性。甘氨酸介导的抑制性神经传递对于脊髓中反射弧的形成、痛觉信息的传递、听觉信息加工和传感信号处理必不可少［14］。GlyR属于配体门控离子通道的半胱氨酸环族。GlyR由5个亚基组成，由α亚基形成或者由α、β亚基组合形成，排列成跨膜的五聚体蛋白复合物。大多数物种的GlyR有4个不同的α亚基(1～4)和1个β亚基，由不同的基因编码。48 ku的α亚基是配体结合型亚基，而β亚基是1个58 ku的结构亚基和93 ku的胞浆锚蛋白-桥尾蛋白［15］。还原性谷胱甘肽、L-丝氨酸和β-丙氨酸等均可作为GlyR的激活配体［16］。由于甘氨酸通过增加氯离子内流来超极化突触后运动神经元，因此，甘氨酸的受体通常也被称为甘氨酸门控氯离子通道。分子证据表明，除了在中枢神经系统，GlyR也在其他和炎症相关的多种细胞类型中广泛分布，如枯否(Kupffer)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、内皮细胞等都存在甘氨酸门控氯离子通道［17］。

2.2 细胞保护作用

已有研究表明甘氨酸能保护动物对抗肽聚糖多糖诱导的关节炎、化学和压力引起的胃肠道黏膜损伤、各种器官的I/R损伤以及出血、内毒素和败血症引发的休克［7］。甘氨酸本身又是一个清除自由基的强效抗氧化剂，是白细胞增殖和抗氧化防御的必需的物质［18］。饲粮供给引发的血液甘氨酸水平上升已经显示出对休克、酒精性肝损伤、某些癌症以及由某些药物导致的肾毒性有显著的改善作用［19-20］。

甘氨酸可以拮抗许多非神经组织和器官的休克和局部I/R损伤，包括肝脏、肾脏、心脏、肠道、骨骼肌等［21］，其保护机制因细胞类型不同而异。在肾细胞、肝细胞和血管内皮细胞中，甘氨酸通过稳定缺血质膜的多孔缺陷发挥其细胞保护作用［22］。目前提出的甘氨酸对抗肝脏I/R损伤的保护机制涉及到了通过Kupffer细胞中GlyR的激活引发了氯离子内流和随后的膜超极化，从而降低了炎症反应和维持细胞能量生成［23］。在肺部的I/R损伤中，甘氨酸通过减少氧化损伤，抑制细胞凋亡来减弱I/R损伤［24］。在肝脏缺血情况下，甘氨酸也可以阻止和细胞凋亡相关的细胞死亡［11］。Lu等［25］研究认为甘氨酸通过抑制神经细胞凋亡减轻小鼠的大脑I/R损伤，其机制可能是通过抑制“内在”(intrinsic，如线粒体)和“外在”(extrinsic，如死亡受体)细胞凋亡途径。

甘氨酸对抗ATP耗竭的细胞保护作用是由GlyR介导的［26］。胞外信号调节激酶 1和 2(ERK1/2)、p38促分裂原活化蛋白激酶和苏氨酸蛋白激酶(AKT)通路构成GlyR偶联的信号传导途径［27］，这表明有一个潜在的抗凋亡特性将能参与到甘氨酸的细胞保护作用中。Pal等［9］研究结果表明甘氨酸可以调节汞诱导的肝细胞的氧化应激和细胞凋亡，甘氨酸通过其很强的活性氧(ROS)清除作用和抗氧化性能而发挥了对汞诱导的肝脏氧化应激的保护作用。此外，除了上调B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和下调促凋亡基因(Bad)表达，甘氨酸也通过下调磷酸化ERK1/2、磷酸化c-Jun氨基端激酶(JNK)、磷酸化p38促分裂原活化蛋白激酶、核因子-κB(NF-κB)和其他线粒体依赖性信号分子的活化而充当抗凋亡分子。

3 甘氨酸免疫调节作用及其分子机制

3.1 抗炎及免疫调节作用

近年来研究表明，甘氨酸还有抗炎及免疫调节作用［8-9］。甘氨酸在调节白细胞分泌的细胞因子数量和免疫功能方面发挥着重要作用［7］。支持这个观点的体外研究表明生理范围内的胞外甘氨酸浓度的增加(0.1～1.0 mmol/L)激活了甘氨酸门控氯离子通道并超极化细胞膜，这些体外研究已在多个细胞种类上进行过，包括巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞［8］。甘氨酸能够抑制脂多糖(LPS)刺激的小鼠肺泡巨噬细胞分泌前炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和过氧化物［28］;人脑巨噬细胞系上的研究结果也表明甘氨酸能抑制 TNF-α及白细胞介素(IL)-1β的表达［29］;甘氨酸还能抑制单核细胞与3T3-L1细胞系中TNF-α和IL-6的表达［30-31］。甘氨酸不影响抗抗原决定簇(CD)3抗体刺激的T淋巴细胞中IL-2的生成，但通过减弱胞内钙离子水平增加并呈剂量依赖式(0.1～1.0 mmol/L)抑制其细胞增殖［32］。体内和体外试验都已经发现甘氨酸抑制Kupffer细胞中TNF-α和IL-6的分泌［33-34］。先前的研究表明，甘氨酸通过抑制Kupffer细胞活性和减少TNF-α分泌来对抗大鼠模型上的多种损伤和疾病［35］。

体内证据也证明，甘氨酸能够降低炎症反应、减少病原感染动物的发病率。甘氨酸可改善糖尿病患者和实验动物上高血糖引起的炎症反应［36］。饲粮甘氨酸的缺乏会损害LPS处理的鸡的免疫应答，而通过饲粮补充可以得到缓减［37］。另外，给注射致死剂量LPS的大鼠饲喂5%的甘氨酸饲粮发现血浆TNF-α水平下降，存活率提高［38］。同样，给犊牛饲喂的牛奶中添加1%的甘氨酸可减少炎症反应并减缓低剂量内毒素感染犊牛的体温升高［39］。在结肠内注射 2，4，6-三硝基苯磺酸或口服硫酸葡聚糖钠诱导的大鼠模型上，饲喂添加5%甘氨酸的饲粮可阻止试验性结肠炎的发生。在这2种肠道炎症模型上，5%甘氨酸的饲粮补充阻止了IL-1β、TNF-α以及细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子和巨噬细胞炎性蛋白在结肠中的表达，从而改善了腹泻和体重减轻的发生［40］。饲粮饲喂甘氨酸4周减缓了内毒素诱发的肺部炎性细胞的涌入［20］。但是也有研究发现，对于手术前的心脏病手术患者，甘氨酸并没有呈现出作为免疫增强营养补充剂的有益作用［41］。

总之，这些研究结果表明甘氨酸是一种新型的具有抗炎、免疫调节和细胞保护作用的天然调节剂。目前，甘氨酸补充对改善人类和动物免疫功能的有效性已被临床试验确定。

3.2 抗炎机制

目前，甘氨酸的抗炎作用机制还没有完全探明，有学者提出是通过甘氨酸门控氯离子通道而增加的氯离子内流参与了其中［42］。甘氨酸通过激活氯离子内流而阻止LPS引发的钙离子的增加从而减少Kupffer细胞有毒介质的合成和释放［43］。这可能涉及到一些调控了与过氧化物酶体增值物活化受体γ(PPARγ)相关的前炎性细胞因子基因的信号转导通路。这些基因包括和NF-κB相关的转录因子家族(Rel/NF-κB)［28，35，42，44］。

分子和药理学证据表明，白细胞中存在甘氨酸门控氯离子通道［8］。这个通道的激活可抑制激动剂诱导的L-型电压依赖性钙通道的开放，从而减少胞内的钙离子浓度。通过超极化白细胞的细胞膜，甘氨酸使得它们对内毒素和多种生长因子的炎症刺激不太敏感。所以甘氨酸对靶细胞的直接效应很可能是多因素的共同作用，即通过抑制甘氨酸门控的氯离子通道而抑制巨噬细胞和中性粒细胞的激活或者炎性细胞的活性，阻止其释放潜在的炎症介质，如毒性细胞因子和前列腺素等，进而阻碍进行性炎症反应过程实现［45］。在许多细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和Kupffer细胞中，甘氨酸可抑制由LPS刺激的细胞内钙的增加，很可能是通过这种机制实现的［7］。

LPS诱导的免疫细胞活化的典型特征就是初始性的细胞内钙离子浓度的增加，而细胞内游离钙的急剧增加充当了细胞信号传递、细胞动员、关键细胞因子的转录和翻译等活动的第2信使信号，这也是超氧化物和TNF-α的产生及几种炎症应答诱导的必要条件。TNF-α是炎症反应过程一个重要和主要的毒性炎症因子，在系统炎症反应过程中起关键作用［46］。但这个钙离子浓度增加的准确机制还不完全清楚，甘氨酸减弱钙离子增加使得超氧根离子(O2-·)生成减少极有可能是通过抑制还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶激活所必需的钙依赖性信号传导来实现的［20，28］。

甘氨酸调节多种细胞类型的能力进一步增强了想解构甘氨酸减缓炎症和损伤的多重作用模式的难度。鉴于甘氨酸给予可以保护一些脏器和肠道炎症性疾病，进一步去确定GlyR在上皮细胞与免疫细胞上的具体作用不仅会增加我们对甘氨酸抗炎和细胞保护作用机制的理解，还能确定可能给治疗这些炎症提供更多特异性治疗的细胞特异性靶信号。Howard等［47］采用人小肠上皮细胞系研究了甘氨酸转运体1(GlyT1)在甘氨酸对抗氧化应激的细胞保护作用中的角色，这种保护依赖于特定的GlyT1活性，强调了细胞内甘氨酸积累的需要。

3.3 甘氨酸对泌乳反刍动物乳腺免疫调控的可能性

产奶量和乳成分是衡量奶牛等泌乳反刍动物经济性能的主要指标。而乳房的健康发育是保障其乳产量和乳品质的主要因素。乳腺炎(mastitis)是导致奶牛产业经济损失最严重的疾病之一。乳腺炎是由各种因素(包括机械、物理、化学及病原微生物等)引起的包括乳腺感染、乳腺炎症、微循环和免疫障碍等的综合征，乳腺感染在各种乳用家畜中普遍存在［48］。当前，我国奶牛养殖业发展迅速，但由于科学管理水平不高，乳腺炎发病率高，危害性大，不仅降低乳产量和乳品质，且随之生产出的乳品由于含有大量的病原微生物、毒素以及残留的抗生素会极大危害人体健康。而对于乳腺炎的防控，由于目前市场上没有理想的疫苗预防，抗生素仍是治疗乳腺炎的主要手段，但是药物残留及耐药菌株产生等问题使人们意识到抗生素等药物不能从根本上解决奶牛乳腺炎的问题。随着人们对食品安全的日益关注，寻求绿色安全有效的非抗生素疗法，成为奶业生产和消费者的迫切需求。因此，通过天然的免疫生理调节剂来调动乳腺固有防御机制，提高乳腺抗感染能力，增强乳腺健康水平，使乳腺炎的防控从被动治疗转向积极干预，从而进一步提高乳品质量和安全具有十分重要的意义。

但目前关于甘氨酸免疫调节作用的研究都集中在人类和啮齿类动物(大鼠、小鼠)模型上，所采用的细胞系也主要是来源于肝脏、大脑、心脏、肠道等部位的巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和Kupffer细胞系，乳腺及其细胞系上的研究未见报道。Jain等［49］《科学》(Science)上发表的研究认为正常人原代乳腺上皮细胞、激活的CD4+T淋巴细胞甘氨酸释放大于消耗，甘氨酸消耗量与癌细胞系增殖速率密切相关，其吸收和生物合成的破坏会减慢细胞的快速增殖。本课题组973项目的前期研究中也发现粗饲料来源为秸秆的奶牛组乳腺释放的甘氨酸显著低于优质粗饲料组，同期进行的生产性能结果也表明乳中体细胞数秸秆组明显高于优质粗饲料组，这是否说明优质粗饲料组奶牛乳腺健康状态好，所需要修复的乳腺细胞少;或者说由于免疫系统的活化干扰了乳腺正常的生理反应而导致对某些特殊氨基酸的需要量增加，使得秸秆组奶牛乳腺中部分甘氨酸被重分配参与免疫反应而导致相对释放量大大降低。甘氨酸能否作为免疫生理调节剂对奶牛乳腺炎症有一定的调节作用，进一步结论尚需试验验证。

4 甘氨酸的安全性评价

甘氨酸是一种基本上无毒性的生理化合物。健康人群可以耐受每天每千克体重0.8 g的甘氨酸剂量［50］。甘氨酸也可按0.8 g/kg BW 的剂量经腹腔注射用作大鼠N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的共激动剂［51］。甘氨酸的半衰期取决于使用剂量，范围在 0.5～4.0 h 之间［52］。以采食量、行为和血、尿相中的代谢指标为基础确定的甘氨酸适宜添加量对动物饲粮的配制是安全可行的［53］。当然，因为甘氨酸作为抑制性神经递质对神经元兴奋性的重要调节作用，人和动物饮食和饲粮的甘氨酸添加量还需要多方面来考虑。

5 小结

尽管快速发展的营养免疫学研究领域已取得了巨大进展，但关于氨基酸对免疫系统调节作用的分子机制还缺乏足够的了解。或许目前方兴未艾的新型高通量技术包括各种组学技术、生物信息学、系统生物学和表观遗传学在内的整合应用会推进这方面研究的深度和广度。相比于谷氨酰胺、赖氨酸、亮氨酸和精氨酸等这些已在动物生产上得到广泛研究和应用的功能性氨基酸，甘氨酸还局限在特定的人类临床应用上，其免疫调节作用与机理还处在试验模型阶段，特别是人和啮齿类动物模型上。随着人们对食品安全的日益关注，我们有理由期待甘氨酸这种天然安全、简单廉价的氨基酸作为免疫调节剂在人和动物生产中得到更深入和广泛的研究应用。

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