星形胶质细胞上调基因-1表达与食管鳞状细胞癌预后的相关性研究

朱传会，李庭赞，王寿九，周烨，李学良

(1.南京医科大学附属明基医院 消化内科，江苏 南京 210019；2.南京医科大学第一附属医院 消化内科，江苏 南京 210029)

·论 著·

星形胶质细胞上调基因-1表达与食管鳞状细胞癌预后的相关性研究

朱传会1，李庭赞1，王寿九1，周烨1，李学良2

(1.南京医科大学附属明基医院 消化内科，江苏 南京 210019；2.南京医科大学第一附属医院 消化内科，江苏 南京 210029)

目的:探讨食管鳞状细胞癌组织中星形胶质细胞上调基因-1(AEG-1)的表达情况及其与临床分期、预后的相关性。方法:应用半定量RT-PCR、Western blotting 及免疫组织化学技术检测AEG-1基因在食管鳞状细胞癌组织中的表达情况，并与肿瘤临床分期特征及预后进行相关性分析。结果:食管鳞状细胞癌组织中AEG-1 mRNA及蛋白表达量分别为癌旁正常组织的8.2～18.5倍及4.6～13.2倍。76例食管鳞状细胞癌石蜡包埋组织中AEG-1 蛋白表达阳性占70例。AEG-1在男性患者中的表达强度强于女性患者，在中晚期病变中的表达强度强于早期病变，另AEG-1表达强度与患者生存时间呈负相关。结论:AEG-1不仅可以用于预测食管癌患者预后，也可能成为一个潜在的基因治疗靶点。

星形胶质细胞上调基因-1； 食管鳞状细胞癌； RT-PCR； Western boltting； 免疫组织化学

星形胶质细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)的发现源于人类免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)感染[1-2]。HIV-1感染导致神经退行性变和HIV-1相关性痴呆(HIV-1 associated dementia，HAD)等中枢神经系统功能障[1]。近年来对AEG-1的深入研究发现，AEG-1不仅促进神经退行性变的发生，还促进肿瘤的进展和转移，是肿瘤发生发展过程中的一个关键基因。在多种体外培养的肿瘤细胞(多形性胶质细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌及肝癌等)和相应的肿瘤组织中发现，AEG-1的表达升高[3-6]。本研究主要通过半定量RT-PCR、Western blotting 及免疫组织化学技术检测AEG-1基因在食管鳞状细胞癌组织中不同水平的表达情况，并与肿瘤临床分期特征及预后进行相关性分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2008年7月至2014年6月南京医科大学附属明基医院临床病理确诊为食管鳞状细胞癌的石蜡包埋标本共76份，其中男55例，女21例，年龄35～76岁。临床分期Ⅰ期3例，Ⅱa期34例，Ⅱb期14例，Ⅲ期19例，Ⅳ期6例。所有病例在手术前均未接受放疗或化疗。另有5例临床手术切除新鲜食管鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织(距癌组织边缘2 cm以内)制作为冰冻切片。

1.2 试剂

AEG-1兔抗人多克隆抗体、GAPDH兔抗人多克隆抗体(EPTOMIC公司)，鼠抗兔二抗(北京中杉金桥公司)，免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥公司)。AEG-1引物5′-AAATAGCCAGCCTATCAAGACTC-3′ (forward)，5′-TTCAGACTTGGTCTGTGAAGGAG-3′(reverse)。GAPDH引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′ (forward)，5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′ (reverse)。

1.3 方法

液氮研磨组织，Trizol法提取总RNA，测OD值定量RNA浓度。利用逆转录酶获取cDNA溶液，保存于-80℃待用。以cDNA为模板，加入AEG-1引物行PCR，GAPDH作为内参。

组织匀浆蛋白样品(BCA法测定浓度)中加入5×Loading Buffer，95℃变性4 min，冷却后等量上样，使用5%的浓缩胶和12%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，80 V，待溴酚蓝进入分离胶后改120 V电泳，待目标蛋白跑至分离胶的中下1/3时停止跑胶。4℃下300 mA转膜3 h。5%脱脂牛奶封闭1 h，4℃一抗孵育过夜，TBST洗膜，二抗孵育1 h，TBST洗膜。ECL发光液孵育膜2 min，暗室内曝光、显影、定影。测定灰度值，进行半定量分析。

石蜡切片常规脱蜡、水合、漂洗，浸于10 mmol·L-1柠檬酸，微波20 min，冷却20 min，漂洗。 3%H2O2中浸泡10 min 封闭内源性过氧化物酶。PAP笔圈出欲染范围，每张片子加50～75 μl 封闭液，室温湿润孵育1 h，50～75 μl稀释的一抗37℃孵育2 h，漂洗，50～75 μl稀释的辣根过氧化物标记二抗37℃孵育1 h，漂洗，DAB孵育10 min，漂洗，苏木素复染，脱水，中性树胶封片。显微镜下观察拍照。

1.4 统计学处理

应用SPSS 13.0统计学软件，对AEG-1在不同临床分期中的表达差异行t检验，对AEG-1表达与临床特征行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AEG-1 mRNA在食管鳞状细胞癌组织中的表达情况

运用半定量RT-PCR法检测所收集5例新鲜食管鳞状细胞癌及癌旁正常组织中AEG-1 mRNA表达情况，结果显示癌组织中AEG-1 mRNA表达量为癌旁正常组织的8.2～18.5倍(图1)。

2.2 AEG-1 蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的表达情况

运用Western blotting 法检测所收集5例新鲜食管鳞状细胞癌及癌旁正常组织中AEG-1 蛋白表达情况，结果显示癌组织中AEG-1蛋白表达量为癌旁正常组织的4.6～13.2倍(图2)。

2.3 AEG-1 蛋白在食管鳞状细胞癌组织中免疫组化结果

运用免疫组化法检测所收集76例食管鳞状细胞癌石蜡包埋组织中AEG-1 蛋白表达及定位情况，结果在70例中检测到AEG-1的表达。不同临床分期食管鳞状细胞癌中的AEG-1蛋白IHC染色明显强于正常组织(图3-4)。

图1 半定量RT-PCR法检测AEG-1 mRNA在5例新鲜食管鳞状细胞癌与癌旁正常组织中表达比值

Fig 1 To detect the expression of AEG-1 mRNA in 5 cases of fresh esophageal squamous cell carcinoma and adjacent normal tissues by semi quantitative RT-PCR

图2 Western blotting法检测AEG-1 蛋白在5例新鲜食管鳞状细胞癌与癌旁正常组织中表达比值

Fig 2 To detect the expression of AEG-1 protein in 5 cases of fresh esophageal squamous cell carcinoma and adjacent normal tissues by Western blotting

2.4 AEG-1表达情况与食管鳞状细胞癌患者临床病理特征相关性

对临床资料进行统计分析显示，AEG-1表达强度与患者性别、临床分期相关。男性患者中AEG-1表达较女性更显著(P=0.037)，中晚期较早期病变表达更显著(P<0.001)。见表1。AEG-1低表达组与高表达组在长期生存率上差异有统计学意义(P=0.01，图5)。

3 讨 论

我国是食管癌发生率及死亡率最高的国家，我国新发食管癌病例约占每年全世界的50%。在我国食管癌高发地区，男性发病率161/10万，女性发病率103/10万[7-8]。由于缺乏有效的能用于早期诊断的生物学标志物，食管癌是癌症相关死亡中的最常见原因，其平均5年存活率仅约10%。近年来，许多研究报告表明，AEG-1与多种细胞生物学行为相关，如癌症细胞存活、细胞凋亡和迁移[9]。 AEG-1在多种人类癌细胞中表达上调，如乳腺癌、多形胶质母细胞瘤、肝癌和前列腺癌[3-6]。

本研究结果表明，AEG-1在食管鳞状细胞癌中高表达，其中AEG-1 mRNA在5例新鲜食管鳞状细胞癌的表达水平明显高于癌旁正常组织，而蛋白水平方面AEG-1在新鲜食管鳞状细胞癌的表达亦明显高于癌旁正常组织。免疫组织化学显示，76例食管鳞状细胞癌石蜡包埋组织中AEG-1 阳性率高达92.11%(70/76)，主要定位于细胞质内。统计分析表明，AEG-1的表达与食管鳞状细胞癌患者性别、临床分期及生存期相关。AEG-1在男性患者中的表达强度强于女性患者，在中晚期病变中的表达强度强于早期病变，另AEG-1表达强度与患者生存时间呈负相关。

迄今为止，国内外多项研究发现，AEG-1参与调节多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及促血管生成。Brown等[5，10]研究发现，在乳腺癌中AEG-1过表达可明显上调Ki67 的表达，而体外研究证实AEG-1促进乳腺癌细胞增殖与细胞周期抑制因子p27(Kip1)和p21(Cip1)的表达下调相关。Liu等[3]研究发现，在胶质瘤细胞中上调表达的AEG-1与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的启动子相互作用，反式激活MMP-9表达从而增强胶质瘤细胞的侵袭性。Kikuno等[4，11]在前列腺癌细胞系LNCaP和PC-3中敲除AEG-1基因后可诱导细胞凋亡，其机制依赖于AKT活性降低而FOXO3a活性上调。此外，敲除AEG-1基因可降低NF-κB和AP-1(activator protein 1)活性，使NF-κB 和AP-1下游蛋白(IL-6、IL-8及MMP-9)表达减少，从而减弱前列腺癌细胞的侵袭力。Yu等[12]研究发现，AEG-1过表达可以促进食管鳞状细胞癌的增殖和锚定独立性生长能力，并证明AEG-1过表达可减少p27的表达及通过 AKT/FOXO3a信号通路诱导cyclin D1表达。Emdad等[13]在AEG-1过表达的脑胶质瘤组织中发现，促血管生成相关分子(血管生成素-1、基质金属蛋白酶-2及缺氧诱导因子1α)表达也相应增高，并通过体外血管生成实验进一步阐明AEG-1促进血管生成是由PI3K/AKT信号通路介导的。

图3 AEG-1在食管鳞状细胞癌组织中的阳性表达

Fig 3 To detect the positive expression of AEG-1 protein in esophageal squamous cell carcinoma by IHC

图4 AEG-1在不同临床分期中表达强度差异分析

Fig 4 To analyze the difference of expression of AEG-1 protein in different clinical stages

表1 AEG-1表达强度与性别、年龄及临床分期的相关性分析

Tab 1 Correlation between AEG-1 expression and the clinical characteristics of the ESCC patients

图5 AEG-1表达强度与生存期的相关分析

Fig 5 Correlation between AEG-1 expression and survival time of the ESCC patients

综上所述，AEG-1在食管鳞状细胞癌的发病中起重要作用，其不仅可以用于预测食管癌患者预后，也可能成为一个潜在的基因治疗靶点。

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Study on the correlation of astrocyte elevated gene-1 expression and prognosis of esophageal squamous cell carcinoma

ZHU Chuan-hui1，LI Ting-zan1，WANG Shou-jiu1，ZHOU Ye1，LI Xue-liang2

(1.DepartmentofGastroenterology，BenQHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210019，China； 2.DepartmentofGastroenterology，theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China)

Objective: To investigate the expression of astrocyte elevated gene-1 (AEG-1) in esophageal squamous cell carcinoma tissue and its correlation with the clinical staging and prognosis.Methods:We used semi quantitative RT-PCR，Western blotting and immunohistochemistry to detect AEG-1 gene in esophageal squamous cell carcinoma tissue and different levels of expression，and analyze relationship with clinical tumor stage characteristics and prognosis.Results:The esophageal squamous cell cancer of AEG-1 mRNA and protein expression were 8.2-18.5 times and 4.6-13.2 times respectively those of adjacent normal tissues.Among 76 cases of esophageal squamous cell carcinoma AEG-1 in paraffin embedded tissue protein expressed in 70 cases. The expression intensity of AEG-1 was higher in male patients than female patients，as well as in advanced lesions than in early lesions，whereas its expression was negatively correlated with the survival time of the patients.Conclusion:Not only can the expression of AEG-1 in esophageal cancer predict the prognosis of patients, but can also be used as a potential molecular target for gene therapy．

astrocyte elevated gene-1; esophageal squamous cell carcinoma; RT-PCR; Western boltting; immunohistochemistry

2015-03-20

2015-08-31

南京医科大学科技发展基金面上项目(SRD20120074)

朱传会(1983-)，女，江苏淮安人，主治医师，在读博士研究生。E-mail:arial.zhu@benqhospital.com

李学良 E-mail：ligakur@aliyun.com；李廷赞 E-mail:benjamin.li@benqhospital.com

朱传会，李庭赞，王寿九，等.星形胶质细胞上调基因-1表达与食管鳞状细胞癌预后的相关性研究[J].东南大学学报：医学版，2015，34(6)：938-942.

R735.1

A

1671-6264(2015)06-0938-05

10.3969/j.issn.1671-6264. 2015. 06．018