小反刍兽疫病原及疫苗的研究进展

吴炳秀 和丽英 云南省迪庆州香格里拉县建塘镇农业综合服务站 674400

1 病原

反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种严重的传染病，主要感染小反刍动物，特别是山羊高度易感。该病毒是副黏病毒科、麻疹病毒属的成员，同属的其他成员还有牛瘟病毒、犬瘟热病毒和海豹瘟病毒等。该病毒外有8.5～14.5nm 厚的囊膜，囊膜上有8～15nm 的纤突，纤突只含血凝素而无神经氨酸酶，但同时具有神经氨酸酶和血凝素活性；核衣壳总长约1000nm，呈螺旋对称，直径约18nm，螺距5～6nm，并且核衣壳缠绕成团。小反刍兽疫病毒粒子在pH 值为5.85～9.5 之间稳定，在pH 值为4.0 以下或pH 值为11.0 以上很快就失活。对乙醚、酒精和一些去污剂敏感，乙醚4℃时经12 小时可将其灭活；用非离子水去污剂可使病毒所有的纤突脱落；酚、2%的NaOH 24小时可将其灭活。该病毒粒子虽然含有血凝素，但是不能对猴、牛、绵羊、山羊、马、猪、犬、豚鼠等大多数哺乳动物和禽的红细胞具有凝集性。国际动物卫生组织(OIE)将该病定为A 类动物疫病，我国规定为一类动物疫病。

2 疫苗研究进展

（1）小反刍兽疫弱毒疫苗。1989年，Diallo 等通过Vero 细胞的连续传代，成功研制了Nigeria 75/1 PPR弱毒疫苗，该疫苗无任何副作用。尽管PPRV Nigeria 75/1 属于I 群，但能交叉保护其他群毒株的攻击感染。但由于PPRV 对热高度敏感，致使Nigeria 75/1 疫苗的稳定性很差，不利于基层运输和使用。用氯仿灭活制备的PPRV 灭活疫苗.在4℃可以保存1年，免疫山羊后血清抗体可持续保存8 个月。但缺点是该疫苗株和野毒株无法区分。为了区别疫苗免疫和强毒感染，2003年，Diallo 等通过反向遗传操作技术，研制出基因工程标记苗，能够将疫苗株与野毒株区分开来。此外，印度利用山羊痘和小反刍兽疫二价弱毒疫苗来免疫羊群，4 周后可抵御强毒的攻击，具有很好的安全性和免疫原性。法国和英国的科学家把PRRV 的F 和H 基因克隆到山羊痘疫苗中，利用重组疫苗有效地预防小反刍兽疫的发生。至今，弱毒疫苗Nigeria75/1 仍是OIE 规定的唯一允许使用的小反刍兽疫病毒疫苗。我国于2007年7月首次在西藏地区发生小反刍兽疫疫情，于2007年10月生产出第一批小反刍兽疫活疫苗Nigeria75/1 株，用于西藏和新疆部分地区的紧急免疫。印春生等通过对该疫苗

进行临床应用研究，结果表明该疫苗在田间大规模使用是安全有效的，疫苗具有良好的免疫原性和较长的免疫持续性。同其他的副黏病毒一样，小反刍兽疫病毒对热非常敏感，这成为了在热带疫区使用活毒疫苗最大的障碍，而且在这些地区基础设施较为落后，难于实现疫苗的低温运输和保存，为克服这一障碍，Worwall 等通过添加含海藻糖的稳定剂研制出了热稳定性冻干疫苗，该疫苗能够在45℃条件下保存14天，这种热稳定性疫苗对小反刍兽疫的防控起到了很大的作用。

（2）灭活疫苗。小反刍兽疫灭活疫苗采用感染山羊的病理组织制备，一般采用甲醛或氯仿灭活。用甲醛灭活的疫苗免疫效果不理想，而用氯仿灭活的疫苗效果较好。

（3）DIVA 疫苗。为了能够在进行免疫计划的同时开展血清学调查，科学家开始研究一种DIVA 标记疫苗。小反刍兽疫病毒感染时诱导机体产生的抗体主要为含量最丰富的N 蛋白和具有中和活性的表面糖蛋白H，因此，小反刍兽疫疫苗最佳的模式就是构建能够表达小反刍兽疫N、H 蛋白的一种重组病毒。Das SC 等以牛瘟病毒基因组为骨架，将其糖蛋白基因F和H 分别替换为小反刍兽疫病毒相应的基因构建了一种用于防控小反刍兽疫的嵌合疫苗。因为这种牛瘟病毒、小反刍兽疫病毒FH 重组病毒在细胞培养中生长繁殖状态不理想，为了改善重组病毒的生长情况，将牛瘟病毒的M 基因也做了替换，在小范围试验中，这种嵌合疫苗可以保护山羊不受小反刍兽疫病毒强毒株的攻击，但相关的鉴别诊断技术仍在研究之中。

（4）基因工程疫苗。基因重组疫苗。麻疹病毒属的表面糖蛋白具有良好的免疫原性，将F 或H 基因在各种载体中表达可用作有效的亚单位疫苗,均能刺激机体产生体液和细胞介导的免疫反应。羊痘和小反刍兽疫都是小反刍动物的烈性传染病，将小反刍兽疫病毒的F 基因插入减毒痘病毒的TK 基因编码区，可以构建重组羊痘病毒疫苗。重组二价疫苗既可抵抗强毒的攻击感染，同时也能预防羊痘病毒的感染。南文金等将小反刍兽疫病毒糖蛋白基因H 插入到山羊痘病毒通用转移载PtkPgpt-egfpP 启动p7.5 子下游，构建了重组山羊痘病毒转移载体PtkPgpt-egfpP-H 并成功转染到绵羊睾丸细胞中，为研究小反刍兽疫基因工程疫苗奠定了基础。王芳等选用腺病毒活病毒载体，插入人工合成密码子优化的小反刍兽疫病毒H 基因，成功构建了表达小反刍兽疫病毒H 基因的复制缺陷性重组人腺病毒载体疫苗候选株。

（2）嵌合体疫苗。嵌合体疫苗是用PPRV 单独或多个糖蛋白基因替代 RPV 基因组中相应的糖蛋白基因。这种疫苗不仅可以对PPRV 产生完全的保护力，而且免疫动物血清中无特异的RPV ELISA 抗体，排除了疫苗免疫对RPV 的血清学干扰。据相关研究表明，用PPRV 的F 和H 蛋白基因单独或二者同时替代RPV 疫苗基因组中的相应蛋白基因，这种嵌合体疫苗不仅安全高效，而且具有标记疫苗的优点，可用ELISA 方法将自然感染和免疫动物进行鉴别。嵌合体疫苗为PPRV 疫苗的研制提供了新的方向。

（3）活载体疫苗。目前使用的疫苗均为弱毒疫苗，存在安全隐患，因此，活载体疫苗的发展前景被研究者们看好。Berhe 等以羊痘病毒为活载体，将PPRV的F 基因插入其TK 基因编码区内，构建了重组羊痘病毒疫苗。用该疫苗对动物进行免疫后攻毒，结果显示当免疫量为0.1 CFU 时即可起到抵抗PPRV 强毒的攻击，同时也能预防羊痘病毒的感染。

（4）核酸疫苗。研究PPRV 核酸疫苗具有十分现实的意义。用核酸疫苗进行免疫类似于自然感染，将抗原以自然方式呈递于免疫系统，不涉及抗原表位的变化，可诱导产生有效的体液和细胞免疫，同时核酸疫苗安全可靠、生产方便、成本低廉。Seth 等构建了PPRV H 基因的真核表达载体，并在动物细胞内进行表达，获得了具有生物活性的PPRV H 蛋白。国内也有研究者构建了包含PPRV F 和H 基因的3 种真核表达载体，将3 种重组质粒转染真核细胞后均成功表达。将3 种重组核酸疫苗免疫山羊并进行特异性抗体检测，发现于第4 周抗体水平达到峰值，与在第3 周达到抗体峰值的弱毒疫苗相比，重组核酸疫苗抗体水平明显较高。以上研究为PPRV 核酸疫苗的正式研制奠定了重要的试验基础。与其他疫苗等相比，核酸疫苗有以下特点：核酸疫苗不存在毒力返强和散毒的危险，免疫应答持久，制备简单、省时省力，不受母源抗体干扰。虽然核酸疫苗优点显著，但毕竟其研究与发展的历史比较短暂，不可避免地存在许多问题，尚待进一步研究解决。

（5）植物疫苗。植物疫苗作为一种口服疫苗在防控PPR 方面具有十分广阔的应用前景。与传统疫苗相比，植物疫苗具有生产成本低、易于保存、具有天然的免疫原性、免疫途径更加安全、免疫途径更加有效、易于推广的特点。Khandelwal A 等应用基因工程的方法在花生植物中表达了PPRV H 蛋白，获得的H 蛋白不但具有生物活性，而且其抗原表位具有天然构象。以该花生植物的鲜叶饲喂山羊后，在山羊体内激发了抗H 蛋白的特异性细胞免疫。今后随着研究的不断深入，应该会有更多用于PPR 防控的植物疫苗问世。

（6）RNA 干涉技术。尽管目前已有有效控制PPRV 和RPV 的疫苗，但一般疫苗都是在接种动物后第14天才能起到免疫保护作用，在紧急情况下，希望有一种治疗制剂来控制PPR 病毒感染。通过合成的小干扰RNA(siRNA)作用于N 蛋白基因的2 个区，导致病毒复制减少了80%以上，通过实时定量PCR 检测病毒RNA、流式细胞仪测定病毒蛋白的产生、CPE 评价病毒粒子的产生和测定病毒效价评价siRNA 对PPRV复制的影响，证明siRNA 分子有发展为PPRV 和RPV治疗制剂的潜力。

3 展望

PPR 已经严重影响了我国羊养殖业，制约着羊养殖业的持续健康发展，而目前使用的弱毒苗具有不耐热、稳定性差、不易运输和保存的特点，因此有效研究PPRV 的感染、入侵、复制、致病及免疫特性，开发一种对热不敏感、易于运输和保存、免疫持续时间较长、安全高效的新型多价苗成为有效防控PPR 的关键。另外，我国应加强做好小反刍兽疫流行病学调查、病原学监测和免疫预防工作，密切关注疫病流行动态信息，有效防止疫情传入境内，一旦发现PPR 疫情，应积极采取扑杀、隔离、消毒及无害化等综合处理措施。

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