反刍动物瘤胃高效产氨菌菌群结构、功能及其调控

申军士 毛胜勇 朱伟云（江苏省消化道营养与动物健康重点实验室，南京农业大学消化道微生物研究室，南京210095）



反刍动物瘤胃高效产氨菌菌群结构、功能及其调控

申军士 毛胜勇 朱伟云∗
（江苏省消化道营养与动物健康重点实验室，南京农业大学消化道微生物研究室，南京210095）

摘 要：对于反刍动物来说，氮的平均利用效率仅为25%左右，绝大部分无效氮随粪尿排出体外。氮素的大量流失不仅造成饲料蛋白质资源浪费，而且加剧环境污染。而反刍动物瘤胃中高效产氨菌（HAB）产氨速率过快，是导致反刍动物氮利用率低的主要原因之一。影响瘤胃内HAB菌群结构与功能的因素有很多，离子载体、植物提取物、细菌分泌的细菌素、饲粮类型等因素均可对瘤胃HAB菌群结构与功能产生影响。本文对瘤胃HAB菌群结构、功能及其调控手段进行了综述，以期为提高反刍动物氮利用效率提供科学依据。

关键词：反刍动物；高效产氨菌；结构与功能；调控

对于反刍动物来说，氮的平均利用效率仅为25%左右［1］，而瘤胃代谢被认为是造成氮无效利用最主要的因素［2］。研究表明，高达1／2的饲料氨基酸氮在瘤胃可被微生物降解产生氨［3］，由于氨的产生速率远远超过微生物的利用速率，造成过量的氨被动物吸收，在体内转化为尿素并大部分随尿液排出体外［4］。氮素的大量流失不仅造成饲料蛋白质资源浪费，而且加剧环境污染。瘤胃中高效产氨菌（hyper ammonia⁃producing bacteria，HAB）产氨速率过快，是导致反刍动物氮利用效率低的主要原因之一［5］。在满足瘤胃内微生物对氨态氮需求的情况下尽可能避免饲料蛋白质在瘤胃分解是提高反刍动物氮利用效率的有效方法［6］。本文对瘤胃HAB菌群结构、功能及其调控手段进行了综述，以期为提高反刍动物氮利用效率提供科学依据。

1　反刍动物瘤胃HAB菌群结构与功能

反刍动物瘤胃内的氨基酸脱氨基作用主要由2种不同的细菌主导，其中一类细菌数量多，但每种细菌的脱氨基活性并不高；另一类细菌数量虽然较少，但每种细菌均具有很高的脱氨基活性和特异性，统称为HAB［7］。尽管第2类细菌数量不超过瘤胃细菌总量的5%，但其产氨速率却是第1类细菌的20～30倍［5］，占瘤胃中总产氨能力的35%～50%。

1．1 瘤胃中HAB菌群结构

1988年，Russell等［8］从奶牛瘤胃中首次分离出了3株高活性产氨菌，Paster等［9］的16S rRNA基因序列分析结果表明这些HAB分别为厌氧消化链球菌（Peptostreptococcus anaerobius）、斯氏梭菌（Clostridium sticklandii）和嗜胺梭菌（Clostridium aminophilum）。1998年，Attwood等［10］从放牧奶牛、鹿和绵羊瘤胃中分离出了多种HAB，但16S rRNA基因序列分析结果表明，所有分离出来的HAB与先前Russell等［8］所分离出的HAB系统发育分类完全不同。随后，多位学者又分别从山羊［11－12］、绵羊［13－14］等分离出了多种新的分类不同的HAB，如坏死梭杆菌（Fusobacterium necropho⁃rum）、肉毒杆菌（Clostridium botulinum）、发酵氨基酸球菌（Acidaminococcus fermentans）、真细菌pyruvativorans（Eubacterium pyruvativorans）、吲哚嗜胨菌（Peptoniphilus indolicus）等。2013年，Rich⁃ardson等［15］从人粪样中分离出了肽和氨基酸分解菌，这些细菌占总细菌数量的3．5%左右，但这些细菌能够分解糖，并且其产氨速率仅为瘤胃HAB 的1／3。虽然所有已分离出的HAB具有很多共同特征，如其生长依赖于氨基酸作为碳源和氮源、不能发酵碳水化合物、对莫能菌素敏感等，但鉴于HAB具有多种代谢类型，并且基因型也有较大差异，大量未纯培养的HAB可能还没有被发现，而它们在瘤胃脱氨基产氨过程中又可能起着非常重要的作用。

1．2 瘤胃中HAB定量检测方法

瘤胃微生物定量检测的常用方法主要有传统滚管法、探针法及实时荧光定量PCR（Real⁃time PCR）法。传统滚管法试验成本低，但过程繁琐，不能追踪某一特定菌株的变化规律。Russell等［8］、Chen等［5］及王志博等［16］多位学者用此方法对瘤胃HAB数量进行了定量，但Attwood等［10］的研究结果表明此方法可能过高估计了HAB数量。探针法于1988年开始用于瘤胃功能菌的定量，该方法可检测某一特定菌株的动态变化规律，但过程复杂、重复性差。Krause等［17］与Wang等［18］采用探针法对瘤胃3种HAB（斯氏梭菌、嗜胺梭菌和厌氧消化链球菌）进行了检测。Real⁃time PCR法于2001年开始用于定量检测瘤胃功能菌数量随饲粮的变化，该方法过程简单、耗时短、反应灵敏，但易受假阳性的干扰。近年来，该方法已在瘤胃纤维降解菌［19］、蛋白降解菌［20］等多种功能菌检测方面得到了广泛应用。但至目前为止，在HAB定量检测方面，该方法仅在斯氏梭菌、嗜胺梭菌2种HAB进行了定量，像厌氧消化链球菌、真细菌pyruvativorans、吲哚嗜胨菌等其他HAB的Real⁃time PCR检测方法还没有报道，而这些HAB又可能在瘤胃氨基酸脱氨基产氨作用中发挥着重要功能。因此，依据HAB的16S rRNA基因序列设计出具有种水平的特异性引物并建立Real⁃time PCR检测方法，使其应用于不同饲粮模式中HAB的定量检测，将为监控瘤胃产氨速率提供一个快速、准确的方法。

1．3 HAB与其他瘤胃微生物关系

在瘤胃蛋白质降解产氨的过程中，HAB与其他蛋白降解菌存在着广泛的协同作用，如已分离的HAB因缺少胞外蛋白酶而不能利用完整的蛋白质［10］，但由于瘤胃中众多的其他微生物含有蛋白酶或肽酶，HAB可以利用这些酶为自身提供可利用的小肽与氨基酸。Chen等［5］研究证实，当HAB（斯氏梭菌）与一些含有肽酶的细菌（如牛链球菌、栖瘤胃拟杆菌等）混合培养时，其产氨量大大增加，这说明瘤胃中微生物的蛋白酶及肽酶确实为HAB提供了丰富的可利用物质，并且作者认为这些HAB在瘤胃中的实际产氨能力可能还远远大于体外培养时所观察到的情况。HAB与瘤胃其他微生物之间除了存在协同作用外，也可能存在拮抗作用，Rychlik等［3］的共培养结果表明，来自饲喂高谷物牛的经洗脱混合瘤胃细菌可以抑制瘤胃HAB生长，但经高压蒸汽处理后的混合瘤胃细菌对HAB生长基本没有影响，作者推测可能与细菌分泌的细菌素或瘤胃存在的大量噬菌体有关，但具体机制尚不清楚。

2　反刍动物瘤胃HAB脱氨基产氨的调控

影响瘤胃内HAB菌群结构与功能的因素有很多，离子载体、植物提取物、细菌素、饲粮类型等因素均可对瘤胃HAB的脱氨基产氨特性产生影响。

2．1 离子载体类抗生素

离子载体种类有很多，如莫能菌素、海南霉素、维吉尼霉素等。目前，研究最多的离子载体为莫能菌素。体外研究发现，莫能菌素能够抑制瘤胃HAB的生长，进而降低氨产生量［17，21］。Yang等［22］体内研究表明，莫能菌素可通过减少瘤胃HAB数量降低瘤胃氨的生成，提高瘤胃内肽和氨基酸的含量。海南霉素的体内、体外研究也证明其具有与莫能菌素相似的作用效果［16，18］。然而，在瘤胃环境中，并不是所有HAB都对莫能菌素持续敏感，一些HAB可能会对抗生素产生耐药性。连续培养结果表明莫能菌素可以抑制牛瘤胃厌氧消化链球菌和斯氏梭菌，但对嗜胺梭菌基本没抑制作用［17］，吲哚嗜胨菌对莫能菌素的抵抗能力也较强［12］。Rychlik等［23］研究结果表明嗜胺梭菌可以通过改变细胞壁的结构来阻止与莫能菌素的结合，但部分HAB具体的抗性机制是否有基因突变、简单诱变或基因转移介导还需进一步研究。随着人们对环境质量及食品安全的认识与要求越来越高，许多国家都对抗生素作为饲料添加剂做出了明确的限制和规定，欧盟已于2006年全面禁止所有抗生素作为饲料添加剂使用，在我国仅有部分抗生素允许作为饲料添加剂，并且有一定的限制，如莫能菌素主要用于肉羊和肉牛生产，而产蛋期蛋鸡、泌乳期奶牛和马属动物则禁止使用。因此，寻找能够替代莫能菌素等抗生素的瘤胃HAB脱氨基产氨调控物质是今后研究的重点。

2．2 植物提取物

随着绿色养殖观念的深入，莫能菌素等抗生素的应用已经受到较大限制，而植物提取物（如挥发油、蛇麻酮等）作为一种天然抗菌成分，近年来在瘤胃发酵调控领域受到广泛关注。Klevenhusen等［24］的Meta分析结果显示，体外添加活性物质后瘤胃氨浓度显著降低。其原因一方面可能与瘤胃HAB脱氨基活性受到抑制有关。先前研究结果表明，部分植物提取物具有抑制瘤胃HAB，降低瘤胃氨态氮浓度的作用［25－27］，但植物提取物对瘤胃HAB作用的特异性、持久性及具体的作用机制还不清楚。另一方面可能与瘤胃原虫作用有关。原虫是瘤胃氨生成的主要微生物，部分植物提取物的添加能够通过抑制原虫生长，进而降低瘤胃氨态氮浓度［20］。鉴于植物提取物具有多种活性成分，并且每种活性成分的抗菌活性又有很大差异，因此，如何选择适当的植物提取物，使其在发挥抑制瘤胃氨生成的同时又不对饲料消化产生负面影响是未来研究及生产应用上面临的一种挑战。

2．3 细菌素

细菌素是由细菌基因组编码、在核糖体内合成后分泌的一种蛋白质或多肽类抑菌物质，在瘤胃内广泛存在。至目前为止，已从瘤胃细菌中分离出了多种细菌素，如Butrivibriocin OR79、Butrivibriocin AR10、Bovicin 255、Bovicin HC5、Bo⁃vicin Sb15和Albucin B等［28］。不同种类细菌素具有极强的选择抑制性，这为寻找特异性抑制瘤胃HAB的细菌素提供了可能。Callaway等［29］报道，HAB（嗜胺梭菌、斯氏梭菌和厌氧消化链球菌）可被乳酸链球菌素（nisin）抑制。Rychlik等［30］也报道，将发酵碳水化合物的细菌和以氨基酸为底物的细菌在瘤胃液中共培养时，碳水化合物发酵细菌分泌的细菌素JL5 BLIS会抑制HAB的活性。Lima等［31］的体外试验表明，细菌素Bovicin HC5可抑制HAB生长，降低氨态氮产量。由于细菌素作为瘤胃微生态调控剂的诸多优势，采用分子生物技术克隆表达特异性抑制HAB的细菌素，或应用转基因技术开发表达特异性细菌素的基因工程菌，将是一个较有前景的研究领域。

2．4 饲粮类型

饲粮影响瘤胃HAB种类与数量，合理的饲粮调制与饲粮配合能够通过降低瘤胃HAB数量进而抑制氨的产生。Attwood等［10］发现从新西兰放牧奶牛、鹿和绵羊瘤胃中分离出的HAB，与先前Russell等［8］所分离出的HAB系统发育分类完全不同，作者认为新西兰草原牧草蛋白质含量高、可溶性碳水化合物含量低等特点促使了这些不同氨基酸和肽发酵细菌的生长繁殖。Rychlik等［3］发现饲喂纯干草牛混合瘤胃细菌产氨速率比饲喂高谷物牛混合瘤胃细菌高2倍，但数学模型估测结果表明饲喂干草牛HAB数量是饲喂谷物牛的4倍多。因此，寻求能够抑制HAB生长、降低瘤胃脱氨基产氨速率，而又不对瘤胃发酵产生负效应并有利于宿主动物发挥正常生产性能的营养调控措施，是挑战反刍动物营养学者的重要课题。

3　小 结

迄今为止人们已对反刍动物瘤胃HAB脱氨基产氨机理进行了初步研究，并提出了一些方法以控制瘤胃HAB的脱氨基作用，但是效果并不是很理想，而且所涉及的HAB菌群结构、HAB与其他微生物的关系等机理也并不清楚。近年来随着基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学及微生物纯培养技术的发展，深入了解HAB在瘤胃蛋白质降解过程中脱氨基产氨的微生物学机理及其调控机制，将从本质上为调控并提高反刍动物氮利用率提供关键科学依据。

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Ruminal Hyper Ammonia Producing Bacteria in Ruminants：Community Structure，Function and Its Manipulation

SHEN Junshi MAO Shengyong ZHU Weiyun

∗

（责任编辑 武海龙）

（Laboratory of Gastrointestinal Microbiology，Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Nutrition and Animal Health，College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

∗Corresponding author，professor，E⁃mail：zhuweiyun＠njau．edu．cn

Abstract：The average nitrogen utilization efficiency in ruminants is only around 25%，and most of inefficient nitrogen is excreted via manure．Excess nitrogen loss is not only a waste of feed protein resources，but also leads to serious environmental pollution．Rapid amino acids deamination by ruminal hyper ammonia⁃producing bacteria（HAB）is one of the main causes for the inefficient use of nitrogen．The community structure and function of ruminal HAB could be affected by many factors，such as ionophore，plant extracts，bacteriocin，and diet types．This review summarizes community structure and function of ruminal HAB in ruminants and its manipulation methods，which aims to provide scientific basis for the improvement of nitrogen utilization effi⁃ciency in ruminants．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（8）：2323⁃2327］

Key words：ruminants；hyper ammonia⁃producing bacteria；community structure and function；manipulation

通信作者：∗朱伟云，教授，博士生导师，E⁃mail：zhuweiyun＠njau．edu．cn

作者简介：申军士（1984—），男，河南开封人，博士，从事反刍动物营养研究。E⁃mail：shenjunshi＠njau．edu．cn

基金项目：国家自然科学基金青年基金（31402101）；江苏省自然科学基金青年基金（BK20140696）

收稿日期：2015－03－02

doi：10．3969／j．issn．1006⁃267x．2015．08．002

文章编号：1006⁃267X（2015）08⁃2323⁃05

文献标识码：A

中图分类号：S811．3