滇西地区10种植物抗疟活性研究
2015-03-23刘子琦肖朝江张小东彭俊霖
刘子琦,肖朝江 ,张小东,徐 伟,彭俊霖,姜 北 *
(1.大理学院药物研究所,云南大理 671000;2.大理学院药学与化学学院,云南大理 671000)
疟疾是严重危害人类健康的疾病之一,全球每年发病人数达3~4 亿,平均年死亡人数近百万,其中绝大多数发生在非洲地区,5 岁以下儿童和孕妇是主要易感人群〔1〕。我国对疟疾进行了长期有效的防治,目前已基本控制了该疾病的大规模流行,但在云南、海南、安徽等地仍时有发生。由于境外多地尤其是与我国接壤的东南亚地区为疟疾高发地区,防治工作不可掉以轻心,与疟疾的斗争仍十分艰巨〔2-3〕。历史上,疟疾的防治主要依靠奎宁等天然药物,随着导致疟疾发生的疟原虫耐药性的不断积累,原有药物疗效日益下降。为此,近年来相继研发出新一代抗疟天然药物青蒿素及相关产品,从一定程度上缓解了抗疟药物疗效退化所带来的压力。然而,从长远发展的角度来看,随着抗疟药物的不断使用,疟原虫耐药性必将逐渐产生,致使抗疟药物疗效下降、进而无法满足抗疟需要乃必然趋势,因此新一代抗疟药物研发刻不容缓。本文以抑制β-羟高铁血红素形成实验的方式〔4-7〕,研究了10种采自云南西部地区的植物样品抗疟活性,为开发新一代抗疟药物提供实验依据。
1 材料
1.1 主要仪器COOL SAFE 95-15 冷冻干燥机(Gene Company Limited);多功能酶标仪(美国Bio Tek 仪器公司);MCO-18AIC CO2培养箱(日本三洋公司);AL204 电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);RE-5205旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
1.2 主要试剂氯高铁血红素、氯喹二磷酸盐、HEPES(美国Sigma 公司);吡啶、冰醋酸(上海申博化工有限公司);乙酸钠(国药集团化学试剂有限公司);二甲基亚砜(天津化学试剂有限公司)。
1.3 植物样品供试的10种植物样品于2014年采自云南西部大理州境内,由大理学院生药学教研室张德全博士鉴定。
2 方法
2.1 植物粗提物的制备取约60 g植物干燥样品,经粉碎后分别用75%乙醇和水回流提取3 次,500 mL/次溶剂,分别将3次醇、水提取液合并,减压浓缩除去大部分溶剂后冷冻干燥成粉末,即醇提取物、水提取物。按公式[冻干粉重量(g)/提取植物样品干重(g)]×100% 计算提取率。
2.2 β-羟高铁血红素形成抑制试验精确称取各植物样品提取物冻干粉5 mg,溶解在1 mL 蒸馏水中,之后用蒸馏水按比例(1:4)稀释成系列浓度溶液,作为供试品溶液备用。将50 μL 不同浓度的供试样品加入96 孔板中,一式3 份,同时设置氯喹阳性对照和蒸馏水阴性对照。随后每孔依次加入50 μL氯高铁血红素储备液(1.0 mmol/L,溶解于DMSO中)和 80 μL 醋酸盐缓冲液(4 mol/L,pH 5.0)与之混合。置于50 ℃培养箱中孵育5 h;取出置室温后,每孔加入100 μL 30%(V/V)的吡啶-HEPES(20 mmol/L,pH 7.5)溶液使微孔板中固体混悬;室温放置10 h后,从每孔中移取50 μL 上清液至另一96 孔板中,之后每孔加入200 μL 吡啶-HEPES(20 mmol/L,pH 7.5)溶液,并在405 nm波长处测定吸收值。由羟高铁血红素标准曲线得出未反应的羟高铁血红素的浓度,从而计算出供试品对β-羟高铁血红素形成的抑制浓度(以IC50表示)〔6-8〕。
3 结果
3.1 10种植物的名称及粗提率10种采自滇西地区的供试植物名称及其醇、水提取物的提取率见表1。其中乙醇提取率为6.9%~33.4%,水提法提取率为1.8%~26.6%。
3.2 植物提取物β-羟高铁血红素形成抑制试验结果10 种植物提取物β-羟高铁血红素形成抑制试验结果见表2。梁王茶(地下)、球花报春花、西域蜡瓣花、糙毛杜鹃4种植物具有不同程度的β-羟高铁血红素形成抑制活性(IC50>1 388.9 μg/mL)。
4 讨论
目前,治疗疟疾的药物主要为氯喹、青蒿素类以及四环素增效剂〔9〕。氯喹能杀灭红细胞内期裂殖体,可迅速有效地控制由间日疟原虫和三日疟原虫以及敏感的恶性疟原虫引起的疟疾,但现已发现恶性疟原虫对氯喹产生抗药性〔10-11〕。青蒿素是黄花蒿中提取的一种倍半萜内酯过氧化物,作为治疗恶性疟最有效的药物之一,被广泛使用于全世界恶性疟原虫流行区,但随着长时间的广泛使用,其敏感性呈缓慢下降趋势,所以研发全新的抗疟疾药物已十分紧迫〔12〕。
表1 供试植物名称及提取率
表2 10种供试植物样品的抗疟活性(±s,n=3)
表2 10种供试植物样品的抗疟活性(±s,n=3)
植物名称氯喹二磷酸盐假烟叶树梁王茶(地上)梁王茶(地下)球花报春花紫堇来江藤板凳果腋花杜鹃糙毛杜鹃苍山滇白珠西域蜡瓣花粗提物—乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水不同浓度(μg/mL)样品的β-羟高铁血红素形成抑制率/%1 388.9 106.6±15.9-6.6±3.3-8.5±3.8-2.8±1.2-1.4±5.3-4.0±1.5-4.8±0.6-8.2±1.5 28.7±6.0-1.8±0.7-9.3±1.9-13.7±1.3-12.7±2.5-15.0±0.7-6.4±1.5-3.1±1.2-3.9±2.5 0.2±2.0 3.3±1.9-3.0±3.2-3.6±1.3-4.4±0.9 7.1±2.4 277.8 98.9±17.1-9.9±1.0-10.4±0.8-1.6±4.2-0.5±3.7-3.5±0.3-2.8±3.0-8.0±0.7-1.5±6.1-8.3±1.7-16.5±1.3-14.9±0.6-10.1±3.3-16.6±0.7-3.4±1.2-2.8±1.9-6.4±0.3 3.4±2.4 1.5±1.7-5.4±1.3-4.2±2.7-9.2±0.1-5.8±0.6 55.6 88.0±13.4 1.0±1.5 4.8±3.3 10.4±0.5 8.8±1.9 4.3±4.3 4.3±1.1 3.5±2.1 2.5±2.3-2.9±4.0-10.1±0.7-12.4±0.7 6.1±3.5-5.9±3.4 3.8±1.1 11.6±5.1 4.2±3.2 12.1±2.8 10.0±3.1 3.6±6.4 8.8±3.1-1.5±2.1 9.8±7.3 11.1-2.2±3.8 9.8±6.1 9.0±1.8 12.7±2.5 9.2±2.9 4.0±2.0 16.5±1.5 8.2±6.6 11.0±3.1 11.0±0.5 3.1±1.2-2.1±4.6 1.8±3.5-0.8±4.7 3.9±0.7 13.5±1.6 9.3±1.7 12.8±4.8 17.1±0.1 3.4±3.4 8.8±5.4 9.2±3.4 12.2±4.5 2.2-3.0±4.6 7.5±2.4 8.5±6.2 7.6±1.8 3.5±4.1 7.1±5.7 7.7±3.4 18.4±1.7 7.5±4.0 10.1±2.4-2.1±0.4 11.6±5.6 1.5±1.7-1.2±3.4 10.1±0.6 12.2±2.8 10.1±0.0 12.1±4.7 13.7±2.9 9.4±2.5 9.6±2.1 10.4±3.2 10.7±2.6 IC50/(μg/mL)34.7±4.4——>1 388.9>1 388.9>1 388.9——>1 388.9— —>1 388.9
β-羟高铁血红素形成抑制实验是一种间接测定药物抗疟活性的方法,具有操作简便、快速、微量等高通量筛选实验的特性,有望成为体外筛选和评价抗疟药物强有力的手段〔4-7〕。本研究利用滇西地区丰富的植物资源以高通量筛选的方法寻找抗疟活性植物样品,为植物来源新型抗疟药物的研发提供了一种新的模式。实验结果表明有4种植物具有不同程度的抗疟活性,其中球花报春花的抗疟活性最好,梁王茶地下部分、糙毛杜鹃和西域蜡瓣花水提取物的活性明显好于醇提物;所选用的植物样品涉及8个科9个属,具有活性的植物样品分布在4个科,说明具有抗疟活性的植物种类较多、分布面广,可以研究发掘的空间很大,这些工作为进一步筛选抗疟活性先导成分提供了基础性依据。
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