木犀草素预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠炎症反应及细胞凋亡的影响

樊维娜 孙经武

陕西省咸阳市中心医院心血管介入科 (咸阳 712000)

木犀草素预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠炎症反应及细胞凋亡的影响

樊维娜 孙经武△

陕西省咸阳市中心医院心血管介入科 (咸阳 712000)

目的：研究木犀草素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤中细胞凋亡和炎症反应的影响。方法：以30只健康雄性Wistar 大鼠为研究对象，随机分为假手术组(A组)，缺血再灌注组(B组)，木犀草素组(C组)，每组10只，术前4d分别经尾静脉注射给予相应处理。阻断冠脉左前降支，构建心肌缺血模型，缺血30min后再灌注2h。用ELISA法检测大鼠血清 TNF-α,IL-6的含量，采用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡指数。结果：与A组相比，B组心肌细胞凋亡指数、血清TNF-α及IL-6含量明显上升(P<0.01)；与B组比较，C组的心肌细胞凋亡指数，血清IL-6和TNF-α的含量则显著降低)(P<0.05或0.01)。结论：木犀草素预处理可以抑制心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡，其机制可能与减少促炎细胞因子TNF-α及IL-6的产生，进而减轻炎症反应有关。

缺血性心肌病是世界性的一个复杂的心脏疾病，它的主要的和最常见的原因是造成管腔狭窄或闭塞的冠状动脉粥样硬化[1]，早期的再灌注治疗是挽救濒死组织的重要策略，但是再灌注本身也会对组织造成损伤，成为缺血再灌注损伤。其发生机制涉及活性氧的大量产生导致的蛋白质、脂质及染色体过氧化损伤，钙离子超载，白细胞聚集，PH反常，ATP能量代谢障碍等。在这其中炎症反应液发挥了重要作用，体现在许多促炎因子如TNF-a，IL-6，IL-1β的释放，对组织造成损伤，严重的可导致细胞凋亡及坏死，因此抑制炎症反应在一定程度上可以减轻心肌缺血再灌注损伤[2]。

木犀草素是一种可以在很多中国传统医药中提取到的黄酮类化合物，既往研究表明其具有多方面的的显著的生物学效应如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等[3]。近年来关于其在缺血性疾病中的研究显示其可以减轻脑缺血再灌注损伤[4]，也可以通过抗氧化作用进行心脏保护。但是目前尚无大鼠心肌缺血再灌注炎症反应方面的研究报告。基于此种原因，我们借助大鼠模型，进一步探索木犀草素在心肌缺血再灌注损伤中发挥保护作用的机制，及该机制是否涉及炎症反应及细胞凋亡。

1 资料与方法 1.1 实验对象 以30只成年雄性Wister大鼠为研究模型，均重200±20g。

1.2 试 剂 木犀草素由陕西惠科植物开发有限公司提供，使用前以0.5%羧甲基纤维素钠(0.5%CMC-Na)制成0.4%的悬浮液。TUNEL试剂盒(南京凯基生物公司)，TNF-α及IL-6 的ELISA试剂盒(厦门慧嘉生物公司)。

1.3 方 法 1.3.1 实验分组:将Wistar雄性大鼠按随机数字表分为如下3组：假手术组(A组)，缺血再灌注组(B组)，木犀草素组(C组)，每组10只。按如下方案给药：假手术组(A组)：大鼠每日经胃灌服0.5%CMC-Na1次，连续5d，剂量是10mL/(kg·d)，未经缺血再灌注处理。 缺血再灌注组(B组)：大鼠每日经胃灌服0.5%CMC-Na1次，连续5d，剂量是10mL/(kg·d)，5d后缺血30min，再灌注120min后取材。 木犀草素组(C组)：大鼠每日经胃灌服0.5%木犀草素1次，50mg/(kg·d)灌胃,余操作同B组。

1.3.2 模型建立:用20%乌拉坦对实验大鼠实施腹腔注射麻醉(剂量9mL/kg)，连接并打开Medlab，连接肢体导联心电图, 颈部切开气管，气管插管行机械辅助通气(通气频率60次/min，潮气量20mL/kg)。在胸骨左缘0.4cm处开胸并进行肌肉分离操作后，切断第4肋并将肋间肌分离，胸膜穿刺并分离心包膜, 挤出心脏。在左心耳下缘约4cm处进针，于肺动脉圆锥左缘出针，把一根聚乙烯管(直径2mm)置于左前降支与结扎线间，用手拉紧结扎线促使聚乙烯管压迫LAD造成冠脉血管急性闭塞，形成急性心肌缺血,在缺血30min后，取出聚乙烯管再灌注2h。观察心电图，以出现ST段显著抬高为结扎成功标志，以缺血区心肌变红、升高的ST段下降50%以上为再灌注成功的标志。A组的大鼠手术过程与B组相同，但只在心肌下穿线不结扎左前降支。

1.3.3 测定IL-6、TNF-α含量：灌注120min后，穿刺抽血3mL(经腹主动脉)，执行离心分离血清，参照TNF-α和IL-6试剂盒说明书，用酶联免疫吸附法(ELISA)进行检测。

1.3.4 TUNEL法检测细胞凋亡指数：再灌注120min后剪下心脏，分离左室心肌，放置在多聚甲醛(4%)固定12 h后石蜡包埋。依照说明进行检测：石蜡切片脱蜡去水，1% Triton X-100透明液促渗，3%H2O2封闭液封闭内源性过氧化酶；滴加反应液；避光反应及转化；显色；苏木精复染；脱水透明；封片镜检。阴性步骤同上，只是不滴加TdT。在光学显微镜下进行观察，凋亡细胞核颜色为深浅不一的棕褐色，心肌细胞核如正常则呈蓝色，切片缺血部位随机选取10个高倍视野(×400 倍)，统计心肌细胞总数和凋亡细胞数。凋亡指数=凋亡心肌细胞数/心肌细胞总数×100%。

1.4 统计学方法 运用SPSS 17.0统计软件，用单因素方差分析的方法进行多组间比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 木犀草素对炎症反应的影响 如表1所示，与A组相比，B组及C组促炎症细胞因子TNF-α、IL-6的含量都明显升高(P<0.01,P<0.05)；而与B组相比，C组TNF-α、IL-6含量明显降低(P<0.05)，差异有统计学意义。

表1 各组大鼠血清IL-6和TNF-α含量

注：与A组比较,△P<0.05, ▲P<0.01；与B组比较,◇P<0.05

2.2 木犀草素对大鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的影响 如图1及表2所示，TUNEL染色结果显示，与A组相比，B组及C组心肌细胞凋亡指数明显增加(P<0.01)；与B组相比，C组凋亡指数明显降低(P<0.01)。

表2 各组大鼠心肌组织AI比较

注：与A组比较,△P<0.01;与B组比较,▲P<0.01

图1 各组大鼠心肌组织TUNEL染色(×400)

3 讨 论 心肌缺血再灌注损伤严重影响着冠心病患者的临床治疗效果和预后，既往国内外研究发现心肌缺血再灌注损伤发生机制复杂，主要包括氧化应激、炎症反应、白细胞聚集等，各种机制之间相互联系，互为因果，最终导致心肌功能和结构障碍，导致心肌细胞凋亡与坏死。心肌细胞凋亡是其中最重要的原因之一。抑制心肌细胞凋亡可减少心肌缺血再灌注对心肌造成的损害。而木犀草素存在于许多中国传统医药中，Shuai Zhang[4]等的研究显示，木犀草素对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用，其机制涉及抗氧化、抗凋亡、抗炎等方面。但目前国内外研究尚未见有对其在大鼠心肌缺血再灌注炎症反应方面的研究报告。既往研究显示炎症反应在心肌缺血再灌注损伤中发挥着重要的作用[5]，炎症细胞的聚集和炎症因子的释放为关键步骤。在炎症反应中，许多细胞因子得以释放，包括TNF-a、IL-6、IL-8等，而这其中，TNF-a是触发心肌缺血再灌注损伤炎症反应的主要因子[6]，其是分子量为17kDa的可溶性多肽，由活化的巨噬细胞分泌，它可通过增加其他促炎细胞因子的释放(如IL-6等)、增加细胞粘附分子的表达，影响中性粒细胞的聚集,并最终引起急性心肌组织损伤。另外TNF-a也可以诱导心肌细胞凋亡、参与血管重构、抑制心肌收缩，对心肌缺血再灌注心肌造成损害。因此抑制TNF-a的表达，在一定程度上可以抑制心肌缺血再灌注的炎症反应，减少心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用。

在本研究中，我们可以发现，与A组比较，B组和C组的心肌细胞凋亡指数均显著增高；但与缺血组比较，药物组的心肌细胞凋亡指数则显著降低，说明木犀草素可以减轻心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡损害。而与A组比较，B组的血清IL-6和TNF-α含量均明显升高，说明缺血再灌注可以激活机体的炎症反应；较之B组，C组的血清IL-6和TNF-α含量显著下降，说明木犀草素可以抑制促炎因子TNF-α及IL-6的产生来减弱炎症反应，减轻其带来的炎症损害。因此，抑制炎症反应可能是木犀草素减少心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡，发挥保护作心肌用的机制之一。

总之，本研究发现木犀草素预处理可以抑制心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡，其机制可能与减少促炎细胞因子TNF-α及IL-6的产生，进而减轻炎症反应有关。

[1] Mozaffari MS, Liu JY, Abebe W, et al. Mechanisms of load dependency of myocardial ischemia reperfusion injury[J]. Am J Cardiovasc Dis, 2013, 3:180-196.

[2] Wang C, Sun H, Song Y, et al. Pterostilbene attenuates inflammation in rat heart subjected to ischemia-reperfusion: role of TLR4/NF-κB signaling pathway[J].Int J Clin Exp Med, 2015,8(2):1737-1746.

[3] Yuan L, Wang J, Xiao H, et al, MAPK signaling pathwaysregulate mitochondrial-mediatedapoptosis induced by isoorientin in human hepatoblastoma cancer cells[J]. Food Chem Toxicol,2013, 53: 62-68.

[4] Zhang S, Qi Y, Xu Y, et al. Protective effect of flavonoid-rich extract from Rosa laevigata Michx on cerebral ischemia-reperfusion injury through suppression of apoptosis and inflammation[J].Neurochem Int,2013, 63(5): 522-532.

[5] 李 军，石 博，黄可欣，等.葛根素对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织Bcl-2、Bax和Caspase-3表达水平的影响[J].中国实验诊断学,2013, 17(4):631-633.

[6] 李健玲,陈兆霓,吕纪华. 玉郎伞皂苷对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(9):250-251.

(收稿2015-07-09；修回2015-08-02)

Effects of luteolin pretreatment on inflammatory reaction and apoptosis of myocardium of ischemia-reperfusion injury in rats

Fan Weina Sun Jingwu

Department of Cardiovascular Interventional Division, Center Hospital in Xianyang City (Xianyang 712000)

Objective:To detective the effects of luteolin pretreatment on inflammatory reaction and apoptosis of myocardium of ischemia-reperfusion(I/R) injury in rats. Method: Male wistar rats were randomly allocated into three groups: sham group (group A), I/R group (group B), luteolin group (Group C), with 10 rats in each group, 4 days before operation were injected via the tail vein giving corresponding treatment. The rats model of myocardial ischemia reperfusion (MI/R) injury was induced by a transient vessel occlusion for 30 min and reperfusion for 2h. The contents of, IL-6 and TNF- were detected by ELISA, and apoptosis index of myocardial cells was detected by TUNEL method. Resuls Compared to group A, group B， myocardial apoptosis index, serum TNF-α and IL-6 levels increased significantly (P<0.01).Results: Compared to group B, serum TNF-α and IL-6 levels and myocardial apoptosis index in group C were significantly lower (P<0.01 or 0.05). Conclusion: Luteolin pretreatment have protective effects on myocardial ischemia reperfusion injury in rats, the mechanism of it may be through down-regulated TNF-α and IL-10 expression to reduce inflammation and inhibit myocardium apoptosis.

Myocardial reperfusion injury/ traditional Chinese medicine therapy Resedaceae/therapeutic uses Animal experimentation Apoptosis

心肌再灌注损伤/中医药疗法 木犀草科/治疗应用 动物实验 细胞凋亡

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.050

△山东省滨州医学院烟台附属医院心内科(烟台264100)