HPLC法测定夜关门药材中槲皮素的含量

杨莲芳

陕西省中医医院(西安710003)

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HPLC法测定夜关门药材中槲皮素的含量

杨莲芳

陕西省中医医院(西安710003)

目的：建立夜关门药材中槲皮素含量的测定方法。方法：采用HPLC法，色谱柱：Agilent HC-C18(150mm×4.6 mm，5μm)；流动相：甲醇-0.3%磷酸水溶液(55∶45)；检测波长370nm；流速：1mL·min-1。结果：槲皮素在1.84μg·mL-1～18.4μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.9992)；平均回收率为97.7%，RSD=1.99%。结论：建立的方法灵敏、准确、重现性好，可有效控制夜关门药材的质量。

夜关门，又名：截叶铁扫帚、绢毛胡枝子等，豆科胡枝子属。有补肝肾，益肺阴，散瘀消肿的功效。全草药用，治遗精，遗尿，白浊，白带，哮喘，胃痛，劳伤，小儿疳积，泻痢，跌打损伤，视力减退，目赤，乳痈[1]。含黄酮类、蒎立醇、酚性成分、鞣质以及β-谷甾醇等成分[2]。黄酮类成分是其主要活性成分之一，具有心脑缺血损伤、肝损伤、心律失常的保护作用及其镇痛,抗自由基和抗肿瘤等作用[3]，因此，夜关门药材中黄酮类物质含量的高低直接影响其药用价值。槲皮素作为黄酮类化合物的代表成分[4]，为此我们采用HPLC法测定了夜关门药材中槲皮素的含量[5]，试验结果表明，该方法灵敏、快速、简便、结果稳定，可为该药材的质量控制提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 高效液相色谱仪(1260型，安捷伦)；紫外可见分光光度计(UV-2012型，尤尼柯(上海)仪器有限公司)；酸度计(PB-10型，赛多利斯科学仪器北京有限公司)；超声波清洗器(KQ-5200E型，昆山市超声仪器有限公司)；精密电子天平(ALC-210.4型，赛多利斯)；KIZ-UV艾柯超纯水机(成都艾柯纯水机厂)。

1.2 试剂 槲皮素对照品(西安应化生物技术有限公司，批号：Qt120428)；夜关门药材(购自藻露堂中药店)；甲醇、乙腈为色谱纯；无水乙醇、三乙胺为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 槲皮素对照品溶液的制备：精密称定对照品槲皮素1.84mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，即得(浓度为36.8μg·mL-1)。

2.1.2 供试品溶液的制备：取夜关门药材约3g，粉碎成细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25mL 80%的甲醇溶液，密塞，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用浓度80%甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10mL，加入1mL盐酸，置90℃水浴中加热回流1h，取出，立即冷却，转移至25mL量瓶中，加浓度80%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液[4]。

2.1.3 空白对照溶液的制备：取除夜关门药材之外的其余成分，照“2.1.2”项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 检测波长的选择：取槲皮素对照品的甲醇溶液，在200～400 nm 波长范围内进行全波长扫描，扫描结果显示槲皮素在200～400nm有三个吸收峰，分别在215nm、255nm和370nm处，其中210nm处溶剂甲醇有末端吸收，干扰较大，250nm处的峰太尖，测定时误差较大，370nm处峰吸收较强且较平缓，故选370 nm作为槲皮素含量测定的检测波长，见图1。

图1 槲皮素的甲醇溶液在200～400nm范围内的UV图谱

2.2.2 流动相的选择：分别以甲醇-水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.3%磷酸水溶液和甲醇-0.5%磷酸水溶液作为流动相[2-5](比例均为50∶50)，将槲皮素对照品溶液分别进样分析，发现随着水相中磷酸浓度的增加，槲皮素色谱峰的对称因子逐渐变大，但甲醇-0.3%磷酸水溶液和(比例均为50∶50)为流动相的色谱峰无显著差异，故选择甲醇-0.3%磷酸水溶液为流动相组成。然后分别以甲醇-0.3%磷酸水溶液(50∶50、52：48和55∶45)为流动相，将槲皮素对照品溶液分别进样分析，结果当本实验的流动相为甲醇-0.3%磷酸水溶液(50∶50)时，槲皮素色谱峰有一定拖尾，且保留时间偏长；调整流动相比例至(52∶48)，槲皮素的色谱峰峰拖尾情况有所改善，保留时间提前，对称因子也略有提高，但是仍不理想；调整流动相的比例至(55∶45)，发现槲皮素色谱峰的对称因子达到了接近0.95，保留时间为6min左右；在此色谱条件下，将供试品溶液进样后发现，槲皮素色谱峰能与溶剂峰以及杂质峰完全分开，因此选定流动相为甲醇-0.3%磷酸水溶液(55∶45)。

2.2.3 色谱柱温度的选择：本实验分别考察了20℃、25℃、30℃柱温下的分离效果，结果显示，柱温越低，色谱峰的出峰时间越长，但柱温过高会影响仪器和色谱柱的寿命。25℃下所测成分能与其他成分达到完全分离，故选择25℃为测定温度。

2.2.4 流速的选择：本实验选择流速为1.0mL/min，此为高效液相分析中常用的流速，流速太高不利于仪器和色谱柱的保护，太低会使各个色谱峰的保留时间延长。

2.2.5 系统适应性试验：分别精密吸取槲皮素对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各20μL注入高效液相色谱仪测定，色谱图见图2。槲皮素的保留时间约为5.9min，与其他组分分离度好，空白对照溶液在槲皮素色谱峰位置无干扰。

A-对照品 B-供试品 C-空白对照

图2 夜关门药材的HPLC图谱

2.2.6色谱柱进样量的选择 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法定量时，以定量环或自动进样器进样为好。本试验采用20μL定量环进行定量分析，以消除进样量误差。

2.2.7色谱条件的确定：色谱柱：Agilent HC- C18柱(4.6mm150mm,5μm)；流动相：甲醇-0.3%磷酸水溶液(55∶45)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：370nm；柱温：25℃；进样体积：20μL。该色谱条件下，槲皮素保留时间为5.9min，样品中其他成分不影响测定。理论板数按槲皮素计算，不低于3500。

2.3 方法学考察

2.3.1线性关系的考察：分别精密量取“2.1.1”项下槲皮素对照品溶液(浓度为36.8μg·mL-1)0.5、1、2、3、4、5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制备成一系列槲皮素对照品溶液，浓度分别为1.84μg·mL-1、3.68μg.mL-1、7.36μg·mL-1、11.04μg·mL-1、14.72μg·mL-1、18.40μg·mL-1的系列对照品溶液。精密吸取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以槲皮素对照品溶液的浓度(X)为横坐标，槲皮素峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：Y=56.19X-107.7，r=0.9992，槲皮素浓度在1.84μg·mL-1～18.4μg·mL-1范围内呈现良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验：精密吸取同一槲皮素对照品溶液，按“2.2.7”项下色谱条件，连续进样5次，每次进样20μL，记录HPLC图谱中槲皮素的峰面积，计算峰面积的RSD为2.14%，上述结果表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验：取夜关门药材5份，每份约3g，精密称定，分别照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，依法进样，进样体积为20μL，按“2.2.7”项下色谱条件测定其峰面积，求其槲皮素含量，计算平均含量为101.7μg·g-1，RSD为1.79%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验：分别取同一夜关门药材供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，12h，按“2.2.7”项下色谱条件下进行测定，进样体积为20μL，测定其峰面积，求得槲皮素峰面积的平均值为168.5，RSD为1.12 %，表明供试品溶液中槲皮素在12h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验：精密量取已知含量的夜关门药材供试品溶液9份，分别精密加入低、中、高浓度的三种槲皮素对照品溶液(每个浓度平行做3份)，按本法测定，分别计算加样回收率和RSD，结果见表1。结果表明，槲皮素的回收率均在93.4%～100.6%之间，平均回收率为97.7%，说明本方法的准确性良好。

表1 加样回收率试验结果(n=3)

2.4 夜关门药材中槲皮素的含量测定 取夜关门药材三份，每份约3g，精密称定，照“2.1.2”方法制备供试品溶液，分别用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，进样体积20μL，按“2.2.7”项下色谱条件测定其峰面积，求其槲皮素含量，结果见表2。

表2 含量测定结果

经过对三份夜关门药材测定，结果夜关门中槲皮素含量在100.3μg·g-1～104.1μg·g-1范围内，槲皮素平均含量为102.3μg·g-1。

3 讨论与结论

3.1 讨 论

3.1.1 关于供试品溶液的制备。①溶剂的选择。分别以甲醇和乙醇作为提取溶剂提取夜关门药材中的槲皮素，结果发现前者的提取率比后者更高。②提取方法的选择。分别采用超声波提取法和回流提取法进行提取，对比发现后者提取率更高，且更有利于夜关门药材中的芦丁分解为槲皮素。故确定供试品溶液的制备为“2.1.2”项下方法。

3.1.2 关于夜关门药材中槲皮素的含量。由于药材中化学成分的含量可受到产地、采收季节、批次以及品质等影响，故本文所测夜关门中槲皮素的含量尚不具有广泛性，具体需在后期研究中作进一步考察。

3.2 结论

本文采用高效液相色谱法测定了夜关门药材中槲皮素的含量，该法灵敏、准确、重现性好，可作为夜关门药材的含量测定方法。

[1] 刘杰书,李泳锋.土家苗药夜关门功能的本草学研究与思考[J].时珍国医国药,2010,21(01)：55-59.

[2] 张 芳,张维民,邱丽筠.铁扫帚化学成分研究[J].中国实用医药,2008,30(3)：53-55.

[3] 朱晓勤，郑孟苏.截叶铁扫帚不同药用部位提取物体外抗氧化活性研究[J].时珍国医国药,2012,23(1)：166-168.

[4] 孟德胜,汪士良.槲皮素及其苷类研究进展[J].中国药房,2012,11(5)：232-233.

[5] 林小明,韦宝含,韦平原,等.槲皮素及其制剂含量测定方法的研究进展[J].时珍国医国药,2006,17(1)：101-102.

(收稿2015-03-26；修回2015-06-18)

Determination of quercetin in Crneate Lespedeza by HPLC

Shaanxi provincial hospital of TCM (Xi’an710003)

Yang Lianfang

Objective：To establish the method for determination of quercetin in Crneate Lespedeza.Methods：The content of quercetin was determined by HPLC.The column was Agilent HC-C18 column (150mm×4.6mm,5μm).The mobile phase was Methanol and 0.3% phosphoric acid solution (55∶45).The detection wavelength was 370 nm.The flow rate was 1 mL·min-1.Results： Linearity range of quercetin was 1.84μg·mL-1～18.4μg·mL-1(r=0.9992).The average recovery was 97.7% and RSD was 1.99%.Conclusion： The methods are proved to be simple,accurate and reproducible.It can effectively control the quality of Crneate Lespedeza.

Crneate Lespedeza Quercetin Determination HPLC

夜关门药材 槲皮素 含量 色谱法，高压液相

R965

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.10.085