大豆SSR指纹图谱身份证的研究进展与展望*

陈 亮，郑宇宏，范旭红，孟凡凡，孙星邈，张云峰，王明亮，王曙明

（吉林省农业科学院大豆研究所/大豆国家工程研究中心，长春 130033）

品种鉴定是种子生产中的重要步骤，也是保护新品种、防止假冒伪劣品种进入市场、维护农民利益的重要手段。生产实践中由于忽视品种真实性的鉴定，往往给农业生产带来无可挽回的损失，因此品种鉴定显得尤其重要[1-2]。传统的形态学鉴定方法主要依据种子、幼苗和植株形态特征、农艺性状的差异，将不同品种区分开来。这种方法简便、经济，但由于许多形态学性状鉴定周期较长、易受环境影响，因此有时很难对品种进行准确鉴定[3]。近年来，随着优异亲本的重复利用以及新种质的匮乏，部分大豆品种出现血缘关系相近、表型特征相似的情况，造成传统的形态学鉴定方法越来越不适应品种鉴定工作[4]。随着电泳技术的发展，蛋白质、同工酶电泳图谱相继被用于品种鉴定[5]。这些方法依据品种蛋白质、同工酶等生化特性方面的差异，可将不同品种准确地区分开，具有速度快、稳定性高、重复性好等优点。但也存在一些问题，蛋白电泳技术对亲缘关系较近的品种难以鉴别，同工酶在不同组织或器官中的分布与活性差异较大，因而导致蛋白质、同工酶电泳图谱在生产实践中无法得到大规模地推广应用[6-7]。随着分子生物学技术的发展，利用分子标记指纹图谱直接反应DNA水平上的差异，成为当今有效、快捷的品种鉴定技术[8]。分子标记指纹图谱技术主要有限制性片断长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片断长度多态性（AFLP）、简单序列重复（SSR）、单核苷酸多态性（SNP）等。其中的SSR标记，与其他分子标记相比，具有周期短、易操作、稳定性好、重复性高、真实可靠等优点[9]。目前，在大豆品种的真伪鉴定、遗传关系分析和解决品种产权纠纷等方面，SSR指纹图谱技术所起到的支持作用受到越来越多地关注。文中综述了SSR指纹图谱身份证技术在大豆品种鉴定方面的应用进展；综合分析了当前SSR指纹图谱身份证构建技术存在的问题，并提出相应的改进方向，以期为科学快速准确地鉴定大豆品种，评价种质资源和解决品种产权纠纷提供参考依据。

1 SSR指纹图谱身份证技术概述

SSR分子标记是一种建立在PCR反应基础上的遗传标记，SSR标记完全符合品种鉴别的4个基本准则，即环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异和实验结果的可靠性。因此，可用来高效准确地检测生物体中的遗传变异，在品种鉴定及种子检测中具有良好的应用前景。国外Ak⁃kaya等首先对大豆中的SSR标记进行了研究[10]，证明其具有高水平的多态性，在大豆基因组中，（AT）n和（ATT）n比较高。国内许占有、邱丽娟等首先利用SSR标记与农艺性状间的对比[11]，证明了利用SSR标记鉴定大豆种质的可行性。

SSR指纹图谱通过比对不同品种SSR指纹图谱照片中的差异可以达到鉴别品种间遗传差异的目的[12]。该方法已广泛应用于大豆、水稻、玉米等农作物品种的鉴定。关荣霞等以遗75-14、中黄14、中品662和中品661共4个品种为试验材料[13]，利用不同连锁群上的SSR引物对其随机选择个体进行分析，为大豆品种资源的保存及品种指纹图谱的建立提供理论依据。Zhou等用水稻微卫星标记POS6.2H构建了57个品种的指纹图谱[14]，其中包括亲缘关系较近的40个美国品种，能全部区分供试品种间的差异。吴渝生等利用SSR标记建立了3个云南省推广的玉米杂交种及其亲本的标准DNA指纹图谱[15]，用于玉米品种鉴定，认为SSR标记具有很高的多态性，非常适用于品种鉴定研究。

SSR指纹图谱身份证是随着分子生物学的发展而建立起来的应用性的遗传种质分析方法，其在指纹图谱的基础上将品种特征数字化，使每个品种都拥有一个属于自己的字符串形式的代码，能够更加简单明了地区分品种[16-18]。此外，SSR指纹图谱身份证数据易于存档记录和分析比较[19-21]。

2 大豆品种SSR指纹图谱身份证技术的应用进展

随着SSR分子标记的不断发掘和检测技术的渐趋完善，SSR指纹图谱身份证技术已被广泛应用于大豆品种遗传特异性的鉴定。高运来等以黑龙江13个育种单位6个积温带的83份大豆品种为材料[22]，利用9对引物将参试大豆品种完全区分开，据此构建了一套黑龙江省大豆品种的分子身份证，并获得全部品种的最优分子特征。丁俊杰等以黑龙江省29个大豆育种单位的103份已鉴定大豆灰斑病3个生理小种抗性的大豆品种（系）为材料[23]，利用与大豆抗灰斑病基因连锁的7个SSR标记构建了供试品种（系）的分子身份证。何琳等以2012年黑龙江垦区区域试验的121份大豆品系为材料[24]，选用10对SSR标记就可将参试品系完全区分开，并构建了121份大豆参试品系的分子身份证。何琳等以长江流域国家区试的45份大豆品种为材料[25]，选择6对SSR标记将参试大豆品种全部区分开，并获得唯一的分子身份证。以上指纹图谱身份证研究结果都能够准确反映供试大豆品种（系）间的遗传差异，并为分子水平上区分鉴别大豆品种（系）提供了参考依据。

目前，已报道的大豆品种SSR指纹图谱身份证技术流程主要如下：首先，提取并纯化大豆植株叶片的总DNA；其次，根据大豆公共遗传图谱，对20个连锁群上均匀分布的、数量较多的SSR引物进行初步筛选；第三，保留扩增清晰、稳定、多态性较高、片段大小适中的引物作为下一步分析的SSR核心引物；第四，根据电泳条带大小，用数字依次记录每一个品种材料用SSR核心引物扩增后的等位基因；第五，依据核心引物的平均等位变异频率，确定用于构建SSR指纹图谱身份证的标准核心引物；最后，将标准核心引物在不同品种中扩增出的所有不同带型进行数字化标识，即为SSR指纹图谱身份证。

3 现有SSR指纹图谱身份证技术存在的问题与改进方向

3.1 SSR指纹图谱身份证编码原则的合理性

目前已报道的大豆品种指纹图谱身份证都采取了相同的编码原则，即根据SSR标记扩增片段的大小，对应的分子量从大到小，依次记录为1，2，3，...，n，然后直接规定了第N个标记引物的扩增结果对应分子身份证的第N位。虽然以上编码方式可以保证指纹图谱身份证每位都只对应1位数，且书写十分简洁，但仍存在不足之处，即当SSR扩增谱带繁多、分布复杂时，该记录、编码方法易出现读带误差且统计困难等情况。针对这一问题，有研究者在小麦、油菜等作物上提出了根据每对SSR扩增的带型间的差别，直接对带型进行整体编号，该方法可以避免人工统计所引起的误差，并有效简化SSR带型的记录[26-27]。在今后的大豆品种SSR指纹图谱身份证构建工作中，也可以借鉴上述编码原则，使每种引物在供试材料中扩增的不同带型都有一个对应的数字标识，提高SSR扩增条带的可读性[28-29]。

3.2 SSR指纹图谱身份证数据的可扩充性

目前已报道的大豆品种SSR指纹图谱身份证构建时使用的标记数量并不是很多，然而所用标记根本无法实现DNA序列的全覆盖，对于可预见的变异还没有一定的标准进行判定[30-31]。在今后的指纹图谱身份证构建工作中，应该考虑在不同连锁群上随机、均匀地挑选多态性的引物，这样对于身份证的准确性和后续身份证数据库的扩容都具有重要意义[23,32]。此外，随着品种数量的增加，现有标记组合无法满足品种鉴定的需求，造成已构建的指纹图谱身份证数据库的局限性日益扩大，这就需要考虑增加新的有效核心标记引物的数量，甚至借助国外的分子指纹图谱研究成果，进一步丰富、完善数据库，从而确保指纹图谱身份证数据库的准确性、及时性和实用性[33-34]。

虽然目前大部分农作物的SSR指纹图谱身份证已相继构建，但这仅仅是对分子标记数据的数字化，并不能完全表示一个品种包含的所有信息。刘新龙等借鉴国家居民身份证的格式[33]，将品种的国圃号、国家地区、育种单位、引物名称和分子数据有序地整合在一起，形成每个品种唯一的识别代码，从这个指纹身份证代码，研究者可以很方便地获取品种的重要信息和分子数据用于品种区分鉴定研究。鉴于品种是育种工作的产物，是农业生产资料，具有商品属性。因此，应结合其重要的商品属性，将品种的商品信息与指纹信息相结合，才能更加准确定位描述一个品种的全部身份信息[27,33,35]。

3.3 SSR标记数据收集、分析的准确性和高效性

目前在构建大豆SSR指纹图谱身份证时，SSR标记数据主要是通过常规聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染技术的检测方法获得，然后依靠人工比对分析标记引物扩增数据。当供试材料和位点较多时，以上数据收集和分析方法显得费时费力，且不同胶板间数据的整合与统计更是一项繁琐的工作，结果的准确性也很难保证[36-37]。最近发展起来的荧光标记毛细管电泳检测技术，利用荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，并通过毛细管电泳自动读取分析产物片段大小[38]。借助该技术能够实现SSR标记与高效、自动化技术的结合，不但可以代替传统银染法人工读胶板的繁琐工作，保证数据的准确性，而且可有效解决不同实验室间的数据整合问题，特别适用于大量供试材料的规模化检测分析[36]。随着分析检测技术的进步和普及，考虑到检测效率和可比性优势，可考虑采用如荧光标记毛细管电泳检测技术作为分析手段，实现高精度及高通量地构建大豆SSR指纹图谱身份证[39-40]。

3.4 指纹图谱身份证在鉴别实质性派生品种上的应用

“实质性派生品种”是国际植物品种权保护联盟（UPOV）提出的概念，指的是由原始品种通过选育、天然或诱导的突变、体细胞克隆、基因导入、同亲本回交而得出的新品种[30]。总的来说，从形态学上很难将实质性派生品种区分开来，只能借助大量分子标记的筛选，从遗传学角度鉴别出他们之间的细微差别和相互遗传关系。此外，由于SSR扩增的目的片段多来自编码基因之间的序列，利用SSR标记区分实质性派生品种本身就存在困难[41]。今后，在利用指纹图谱身份证技术鉴别实质性派生品种的工作中，一方面可以考虑选择较高区分效率或特异区分能力的引物，另一方面可以考虑利用不同类型分子标记之间的互补来综合鉴别。此外，如何定义实质性派生品种间遗传差异的变异幅度也是一个值得深入探讨的问题[42-43]。

4 展望

比较于传统田间种植鉴定方法，指纹图谱身份证技术在鉴别品种间差异方面，具有简单明了、不受环境影响等独特优点。但由于目前获得的与表型性状相应的SSR分子标记数量十分有限，且SSR标记主要扩增的是与表型性状关系不大的非编码序列[30,44-45]，这就导致在品种鉴别时，通过选用具体分子标记获得的指纹图谱身份证结果，在表型特征方面存在一定缺陷。随着全基因组测序技术的发展，人们对于基因功能的深入研究，有可能在标记与性状之间找到更紧密和相关的联系，使得传统的形态学鉴定与分子标记鉴定紧密结合，最终建立更加完善的品种特异身份证技术体系，为品种在分子水平上的鉴定和知识产权保护提供可靠的科学依据[40,46-47]。

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