酶强化茶皂素修复重金属污染土壤的研究

林维晟，龚新怀，胡家朋，吴海泉，徐颖惠

(1.武夷学院 生态与资源工程学院/绿色化工技术福建省高校重点实验室，福建 武夷山 354300；2.福建邵化化工有限公司，福建 邵武 354000)

酶强化茶皂素修复重金属污染土壤的研究

林维晟1，龚新怀1，胡家朋1，吴海泉2，徐颖惠1

(1.武夷学院 生态与资源工程学院/绿色化工技术福建省高校重点实验室，福建 武夷山 354300；2.福建邵化化工有限公司，福建 邵武 354000)

茶皂素；酶；重金属污染；土壤；修复；响应面法

以多种重金属污染的土壤为材料，研究了生物酶、茶皂素和两者组合等处理方式对重金属的去除效果。结果表明：酶和茶皂素对土壤中重金属有良好的去除效果，起到协同、互补作用。采用响应面法优化反应条件，得到pH值4.0、反应温度35℃、茶皂素溶液和酶溶液配比3 ∶1的最佳淋洗修复条件，此时Cd、Cr、Cu、Ni、Zn去除率分别为88.87%、81.64%、43.33%、47.16%、62.03%，去除率的大小顺序为Cd>Cr>Zn>Ni>Cu。酶与茶皂素组合淋洗液能有效去除酸提取态、可还原态和可氧化态的重金属，表明组合液在重金属污染土壤修复方面具有较好的应用前景。

土壤是人类赖以生存的物质基础，当重金属元素通过各种途径进入土壤环境后，容易存留于土壤而被农作物吸收，进而通过食物链对人体及生态造成危害。土壤重金属污染具有隐蔽性、积累性、滞后性和长期性的特点，治理难度很大[1-2]。重金属污染土壤修复研究已成为土壤修复的重要课题。在众多土壤修复技术中，淋洗技术被认为是一种可广泛应用、很有发展潜力的修复方法[3]，其中生物表面活性剂具有低毒性、可生物降解、表面活性高等优点，可回收加以重复利用，具有较高的经济价值[4-6]。目前，研究较多的生物表面活性剂有鼠李糖脂、槐糖脂、皂角苷等[7]，其中以皂角苷等最为常见，且价格相对便宜，目前已被广泛应用于制药、环保、化妆品和洗涤剂制作等领域。由于土壤污染具有多样性和复合性，因此单一的生物表面活性剂往往难以取得良好的修复效果。而生物酶是一种理想的生物螯合剂，具有对环境营养条件要求不高，对低浓度污染物处理更有效的特性，在和毒物共存时能保持较高活性，在土壤中具有较大的移动性，相比微生物、植物对重金属污染土壤的处理更具优势[8-9]。利用生物表面活性剂和生物酶组合可有效提高重金属污染土壤的处理效果。因此，本研究尝试将酶与茶皂素组合应用于污染土壤中Cd、Cr等重金属的淋洗、解吸、去除，探讨了茶皂素和酶对重金属的去除效果，并利用响应面法对组合液的去除反应条件进行优化，通过对去除前后土壤中重金属的存在形态进行比较，综合评价复合洗脱的效果，以期为重金属污染土壤修复技术研究提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 供试土样

土壤样品采自武夷山市武夷学院明月湖边，为黏土，自然风干后，过100目筛，用于制作人工污染土壤样品。将100 g土壤样品浸入由CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、Cd(NO3)2·4H2O、Cr(NO3)3·9H2O、NiCl2·6H2O配制的500 mL混合溶液中(含Cu、Zn、Cd、Cr、Ni分别为100.5、439.7、4.8、365.2、128.1 mg/L)，恒温振荡72 h，离心除去上层清液，自然风干陈化2周，备用。经测试，该人工污染土壤样品pH值为6.80，有机质含量为2.87%，阳离子交换容量为12.45 cmol/kg，Cd、Cr、Cu、Ni、Zn含量分别为2.38、93.33、279.38、148.39、89.68 mg/kg。

1.2 试剂与仪器

试验采用茶皂素(上海鑫纯化学试剂有限公司)，临界胶团浓度(CMC)为0.53 g/L；生物酶(实验室自制)，酶活为3 200 U/g。试验仪器为AA-6300原子吸收分光光度计(日本岛津公司)等。

1.3 试验方法

(1)酶处理重金属污染土壤工艺条件。精确称取0.6 g人工污染土壤样品置于锥形瓶中，加入酶溶液15 mL，在不同的质量浓度、反应时间、pH值条件下，35 ℃恒温振荡12 h。离心分离后，取上清液用火焰原子吸收分光光度法测定各重金属含量。

(2)茶皂素处理重金属污染土壤工艺条件。精确称取0.6 g人工污染土壤样品，加入茶皂素溶液15 mL，在不同的质量浓度、反应时间、pH值条件下，25 ℃恒温振荡12 h。离心分离，测定各重金属含量。

(3)酶与茶皂素组合处理重金属污染土壤工艺条件。在上述试验的基础上，精确称取0.6 g人工污染土壤样品加入不同配比(茶皂素溶液体积 ∶酶溶液体积)的茶皂素和酶组合液共20 mL，恒温振荡12 h，测定各重金属含量。在单因素的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以组合液的pH值、反应温度、配比3个因素为自变量，重金属去除率为响应值，进行三因素三水平的响应面分析试验，试验因素与水平见表1，以确定土壤重金属去除的最佳工艺条件。

表1 响应面法分析因素与水平

(4)重金属形态的测定。称取10.0 g人工污染土壤样品，用茶皂素与酶组合液处理，在最佳工艺条件下，恒温振荡12 h，离心后去除上层清液，风干。分别称取组合液处理前后土壤样品各3份，每份2.5 g，土样中重金属形态采用BCR法分级提取，原子吸收分光光度法测定，分别测得酸提取态、可还原态、可氧化态和残渣态等4种形态的重金属含量。

2 结果与分析

2.1 酶溶液pH值、质量浓度和反应时间对重金属去除率的影响

pH值是影响土壤重金属去除率的重要因素。Wasay等[10]研究表明，当反应pH值为3.0～5.0时，土壤的理化结构会被破坏，大部分有机螯合物所带的羧基容易发生分解，而羧基发生分解后才能和重金属结合。为考察酶溶液pH值变化对重金属去除率的影响，经初探性试验，本试验设置pH值范围为3.4～5.0，结果见图1。由图1可知，酸性较强时，酶对重金属的去除率较高，说明酶分子中的巯基和羧基在酸性条件下易分解，与重金属产生良好的络合，其中：Cr、Cd在土样中的存在形态以酸提取态为主，在酸性条件下，去除率变化较大；Cu、Zn、Ni在土样中的存在形态以可还原态、可氧化态和残渣态为主，酶较难与之络合，去除效果相对不理想。

酶质量浓度对重金属去除效果影响的试验结果见图2。由图2知，酶质量浓度低于0.20%时，重金属去除率随酶浓度的升高而增加，主要原因是酶作为蛋白质，需要一定量的重金属离子作为辅基，在反应初期重金属的加入能促进酶活性中心与底物产生配位结合，使酶分子及其活性中心保持一定的空间结构，酶催化反应改变了平衡性质和酶蛋白的表面电荷，增强酶活性，起激活作用[11]；当酶质量浓度超过0.20%时，重金属去除率有所下降，主要原因是重金属占据了酶的活性中心，或与酶分子的巯基、胺基和羧基结合，导致酶活性降低，抑制了酶促反应[11]。

图1 酶溶液pH值对重金属去除效果的影响

图2 酶质量浓度对重金属去除效果的影响

反应时间对重金属去除效果影响的试验结果见图3。由图3可知，反应时间低于12 h时，重金属去除率随反应时间的增加而升高；反应时间达到12 h后，重金属去除率基本趋于稳定。其机理可能是在反应初期受传质阻力等影响，酶溶液不易进入土壤中与重金属相结合，因而去除率较低，随着反应时间增加，酶促反应增加，重金属的去除率也就提高了；反应中后期，酶的活性中心达到饱和，形成较稳定的络合物，产生与底物的竞争性抑制作用，因此酶促反应速率保持恒定[12]。

图3 酶溶液反应时间对重金属去除效果的影响

2.2 茶皂素溶液pH值、质量浓度和反应时间对重金属去除率的影响

pH值是影响茶皂素去除重金属的重要因素，溶液pH值对重金属去除效果影响的试验结果见图4。由图4可知，溶液pH值为3.0～4.0时，土壤中各重金属的去除率呈一定上升趋势；pH值为4.0～7.0时，去除率又有明显下降。分析其原因可能是，pH值为3.0～4.0时，酸性较强，茶皂素中的羧基容易脱氧离子化，降低了茶皂素的CMC(临界胶束浓度)，形成更多小型胶束，茶皂素更易与重金属进行络合，增大重金属的去除率；pH值为4.0～7.0时，酸性减弱，茶皂素中的羧基不容易脱氧离子化，不利于重金属的去除。同时，重金属在土壤中形成了不同的化学形态，表现出不同的活性与生物有效性。一般来讲，pH值为4.0左右时，酸提取态的重金属随有机物的降解得到释放，容易被生物吸收，因此Cr、Cd去除率较高；而可还原态、可氧化态和残渣态的重金属稳定程度相对较大，不易释放，因此Cu、Ni、Zn去除率不高。

图4 茶皂素溶液pH值对重金属去除效果的影响

茶皂素质量浓度对重金属去除效果影响的试验结果见图5。由图5可知，当茶皂素质量浓度较低时，以单分子形式吸附重金属，重金属去除率较低；随着质量浓度的增大，超过其临界胶束浓度，可形成胶团，这种胶团将重金属包围转移到液相，同时阻止了重金属与土壤颗粒的重新结合，则重金属去除率明显提高；茶皂素质量浓度增加，重金属离子的去除率随之提高，但浓度增加到一定数值后，与重金属的络合反应达到平衡，重金属的去除率趋于稳定，因此去除率又有所下降[13-14]。

反应时间对重金属去除效果影响的试验结果见图6。由图6可知，反应时间在12 h内，随着时间的增加，各重金属的去除率明显上升，12 h后各重金属去除率变化不大。这可能是因为土壤中的重金属和茶皂素之间络合反应的传质过程需要一定的时间，随振荡时间的增加，传质作用增强，茶皂素进入土壤内部增多，增溶作用增强，重金属去除率提高。此外，在土壤修复过程中，茶皂素去除重金属效果还受到金属形态、土壤理化性质等因素的共同影响，并且随振荡反应时间的增加，重金属存在重新从水相转移到土壤中的可能性。在反应后期，各重金属的解吸与吸附达到动态平衡，去除率变化不大。

图5 茶皂素质量浓度对重金属去除效果的影响

图6 茶皂素反应时间对重金属去除效果的影响

以上试验研究表明，在相似反应条件下，茶皂素和酶对重金属都有一定的去除效果：茶皂素对Cd、Cr、Zn、Ni有一定去除效果，对Cu的去除效果不理想；酶对Cd、Cr、Zn、Cu有较好的去除效果，对Ni的去除不理想；茶皂素和酶在重金属去除上形成一定的互补性，说明酶强化茶皂素去除土壤中重金属是可行的，有利于提高去除效果，实现土壤的“绿色修复”。

2.3 酶与茶皂素组合处理重金属污染土壤最佳工艺条件

2.3.1 酶与茶皂素配比

采用质量浓度0.2%的酶溶液与质量浓度3.0%的茶皂素混合液对供试土壤进行处理，试验结果见图7。由图7可知，保持混合液总量(20 mL)不变，随着茶皂素加入量增大，各金属离子去除率呈上升趋势；当茶皂素溶液加入量达15 mL时，重金属的去除率有所下降，即茶皂素加入量15.0 mL、酶加入量5.0 mL、茶皂素溶液和酶溶液的配比为3 ∶1时，各重金属的去除率达到最大值。试验表明，一方面酶能增加茶皂素处理效果，表现出协同增溶、去除作用；另一方面茶皂素用量大于酶的用量，说明重金属的去除其传质阻力可能来自于将重金属从土壤中的增溶、洗脱过程，而重金属与酶螯合作用阻力小，更易进行。

图7 不同配比的反应液对各重金属去除率的影响

2.3.2 组合液处理重金属污染土壤试验分析

以Cd为例，采用统计软件Design Expert进行试验设计并优化，结果见表2。以pH值、配比、反应温度3个无因次因素为自变量、Cd去除率为响应值，得到Cd去除率对3个无因次因素的二次多元回归方程为

Y=195.088 4+0.042 1X1+49.401 8X2+

5.281 3X3+15.192 0X12+109.279 7X22+

6.261 8 X32+0.000 1 X1X2+0.012 1 X1X3+

(1)

式中：Y为Cd去除率，%；X1为pH值；X2为酶和茶皂素组合液配比；X3为反应温度，℃。

表2 回归模型方差分析

同理，利用响应面法对Cr、Cu、Ni、Zn进行分析，结果表明各回归方程拟合度和可信度均较高，试验误差较小，方程模拟效果好，可用于酶与茶皂素组合处理重金属Cr、Cu、Ni、Zn污染土壤工艺研究的试验分析与预测。各因素在试验范围内对去除率的影响大小均为pH值(A )>反应温度(C)>溶液配比(B)。在各因素选取范围内，通过Design Expert软件分析回归模型，得出最优去除率工艺参数为pH值 4.0、反应温度35 ℃、溶液配比 3 ∶1。响应面法预测出来的最佳结果Cr、Cu、Ni、Zn去除率分别为81.88%、43.47%、47.23%、62.09%。经重复试验，Cr、Cu、Ni、Zn去除率分别为81.64%、43.33%、47.16%、62.03%，与理论预测值相比，相对误差分别为2.9‰、3.2‰、1.5‰、0.97‰，结果较理想。5种重金属去除率的大小顺序为Cd>Cr>Zn>Ni>Cu。

2.4 修复前后土壤中重金属形态变化

在最优去除工艺参数条件下，利用BCR法对组合法处理前后土壤中各重金属的形态分析结果见图8。Cd、Cr主要以酸提取态存在，Cu、Ni、Zn主要以可氧化态、残渣态存在。处理前，Cd的酸提取态含量为58.40%，可氧化态、残渣态和可还原态含量分别为23.94%、9.67%和7.99%；Cr以酸提取态含量为主，可还原态和残渣态含量相对较少；Ni主要以残渣态存在，残渣态含量为40.10%，可氧化态、酸提取态和可还原态含量分别为29.80%、18.17%、12.03%；Cu、Zn主要以残渣态存在，其含量分别为30.12%、52.99%。经茶皂素和酶处理后，各形态的重金属含量都有所减少。酸提取态的Cd几乎全部被去除，可氧化态含量明显下降，可还原态与残渣态的含量也有所减少。Cr的各形态重金属变化规律与Cd基本相似。对于Cu、Ni和Zn，组合液对酸提取态(交换态和碳酸盐结合态)的去除效果较好，去除率分别为82.94%、52.78%、42.78%；对可氧化态的去除率分别为81.47%、50.53%、46.67%；可还原态，Cu、Ni的去除率为46.48%、51.69%，Zn去除率不高。残渣态Ni的去除率仅为33.45%，去除率较低。朱清清等[13]、李光德等[15]研究表明用皂角苷淋洗条件下，酸提取态的重金属最易被去除，其次为可还原态，可氧化态和残渣态的重金属则很难被去除。本试验结果表明，酶与茶皂素组合的淋洗液对酸提取态的重金属去除效果最好，对可还原态、可氧化态的重金属也有一定的去除效果。

图8 茶皂素与酶对土壤中重金属形态的影响

3 结 语

(1)酶与茶皂素组合液对土壤中重金属都具有一定的去除效果，尤其是溶液质量浓度和pH值对重金属去除效果影响较大。茶皂素和酶有相似的去除反应条件，且在重金属去除方面有一定的互补，因此两者组合对重金属污染土壤进行生态修复是可行的。

(2)优化试验结果表明，采用质量浓度0.2%的酶和质量浓度3.0%的茶皂素组合液作为淋洗液，在pH 4.0、反应温度35 ℃、配比3 ∶1的最佳淋洗修复条件下，Cd、Cr、Cu、Ni、Zn去除率分别为88.87%、81.64%、43.33%、47.16%、62.03%，去除率的大小顺序为Cd>Cr>Zn>Ni>Cu。

(3)修复前后土壤中重金属的形态变化表明，因不同存在形态重金属与酶、茶皂素的络合能力不同，故其去除率差别较大。酶与茶皂素组合淋洗液能有效去除酸提取态、可还原态和可氧化态的重金属，与单一使用茶皂素相比较，重金属去除率有一定的提高，同时也减少了茶皂素用量，有助于降低处理成本，表明酶与茶皂素组合可用于重金属污染土壤的修复。

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(责任编辑 李杨杨)

福建省科技厅区域重大项目(2012Y3008)；福建省教育厅高校专项项目(JK2011058)；南平市科技局科技计划项目(N2012Z06(4))

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1000-0941(2015)06-0044-05

林维晟(1972—)，男，福建福州市人，讲师，硕士，主要从事环境生物技术方面的研究。

2014-09-16