鲈鱼ZnT基因的cDNA克隆及生物信息学分析

舒欢欢， 郑伟贤， 钱云霞

(宁波大学 海洋学院 应用海洋生物技术教育部重点实验室， 浙江 宁波 315211)

鲈鱼ZnT基因的cDNA克隆及生物信息学分析

舒欢欢， 郑伟贤， 钱云霞

(宁波大学 海洋学院 应用海洋生物技术教育部重点实验室， 浙江 宁波 315211)

锌转运蛋白(zinc transporters, ZnT)在细胞锌的储藏，释放和分布中起了重要的作用。运用RT-PCR和SMART RACE方法从鲈鱼肝脏克隆得到了鲈鱼ZnT基因全长cDNA序列。结果显示，鲈鱼ZnT全长为1747 bp，包括5′非翻译区84 bp，3′非翻译区490 bp，开放阅读框1173 bp，可编码390个氨基酸。生物信息学分析表明该蛋白有6次跨膜结构，N端和C端均位于细胞膜内侧，第IV和第V跨膜区之间的环富含组氨酸。鲈鱼ZnT的氨基酸序列与其他生物的ZnT7序列有高度的相似性：斑马鱼，85.6%；大西洋鲑，85.4%；红鳍东方鲀，84.3%；人，75.1%；小鼠，73.8%。聚类分析显示鲈鱼ZnT首先与其它鱼类和人ZnT7成一簇，再与鱼的其他类别ZnT聚合，说明分离到的鲈鱼ZnT为ZnT7。

鲈鱼; ZnT; 克隆

锌是生物体必需微量元素，参与了细胞内许多不同的代谢过程。首先，锌作为多种酶的辅助因子参与机体的生理生化反应；其次，锌通过锌指机构域而调节DNA复制，RNA转录以及基因的表达等作用；另外，锌还可以作为功能成分稳定跨膜蛋白的结构等，因此细胞内锌的稳定和平衡对机体非常关键[1-3]。锌在细胞的平衡主要由细胞膜和细胞器中两大类锌转运蛋白(zinc transporters)的活力决定。一类是Slc30(solute-linked carrier 30)基因编码的锌转运蛋白家族(zinc transporter family, ZnT)，也叫阳离子扩助蛋白 (cation diffusion facilitator, CDF)家族；另一类是SLC39(solute-linked carrier 39)基因编码的ZRT/IRT类似蛋白(ZRT/IRT-like protein，ZIP)家族[2-3]。ZnT的作用是通过将锌从胞内运送到胞外空间或运入至细胞器从而降低胞内锌的含量，而ZIP家族的作用则相反，当胞浆内锌含量低时将锌从细胞器运入胞内而提高胞内锌含量[2-3]。迄今在哺乳动物中已发现10个ZnT家族成员(ZnT 1～10)和14个ZIP家族成员(ZIP 1～14) 。

锌元素是鱼类重要的营养元素，但是过量的锌元素对鱼类有毒性，尤其在水环境中[4]。作为吸收和转运锌元素的关键蛋白，ZnT在鱼类的研究中鲜有报道，在NCBI数据库，我们仅发现有斑马鱼(Daniorerio)、大西洋鲑(Salmosalar)和红鳍东方鲀(Takifugurubripes)等少量基因序列，而文献只见关于斑马鱼锌转运蛋白在发育中作用的报道[5-6]。鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)俗称白花鲈，青鲈，七星鲈鱼，是浙江省海水网箱养殖的主要品种。我们用SMART RACE方法从鲈鱼肝脏中克隆ZnT基因的全长cDNA序列，并对其结构进行了生物信息学分析，为今后研究ZnT在鱼类锌元素的转运和代谢中的作用和机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

实验对象： 实验所用的鲈鱼取自宁波象山港黄避岙某养殖场。

实验试剂： 常规PCR所需试剂和pMD18-T均为TaKaRa公司生产；SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit为Clontech公司产品；RNAiso Plus试剂，质粒小量抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒由碧云天生物技术有限公司生产；其余试剂为国产分析纯试剂。大肠杆菌 (Escherichiacoli) DH5α菌株由本实验室保存。实验所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 鲈鱼ZnT基因的克隆

根据已知的斑马鱼、红鳍东方鲀及大西洋鲑的ZnT保守序列，设计兼并引物ZnT-F和ZnT-R用于克隆鲈鱼ZnT基因的保守区(序列见表1)。PCR反应体系50 μL：25 μL Premix Taq，10 μmol/L上下游引物ZnT-F和ZnT-R各2 μL，2 μL模板DNA，用ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件为：94℃预变性4 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经1.2%琼脂糖电泳后，将目的条带切胶回收、连接T-载体、转化感受态大肠杆菌DH5α后，挑选阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行测序。

根据得到的ZnT核心片段的cDNA序列，分别设计3′-RACE和5′-RACE基因巢式引物(见表1)。按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit说明书，用鲈鱼肝脏总RNA分别合成3′Ready和5′Ready cDNA，分别进行3′-RACE和5′-RACE扩增，PCR产物进行克隆测序，具体同上。

1.3 鲈鱼ZnT的结构分析

BioEdit软件进行氨基酸序列推导及同源性分析。在线http://www.cbs.dtu.dk/ services/ TMHMM/对ZnT蛋白跨膜区域进行预测。蛋白序列的保守结构域由在线软件InterProScan分析http://www.ebi.ac.uk/interpro/ (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)。跨膜蛋白2D拓扑学结构用TOPO2 (http://www.sacs.ucsf.edu/cgi-bin/open-topo2.py)软件分析 (Johns 2010)。使用MEGA6.05软件，通过临位相连法(Neihbor Joining, NJ)对鲈鱼ZnT和GenBank中已收录的其它已知动物的ZnT氨基酸序列进行分子进化树聚类分析。

表1 鲈鱼ZnT基因克隆及PCR引物

2 结果与分析

2.1 鲈鱼ZnT基因的序列及功能位点分析

利用兼并引物ZnT-F和ZnT-R从鲈鱼肝脏cDNA中扩增得到一目的片段，克隆测序片段大小为740 bp，经过BLAST比对分析确认为鲈鱼ZnT的核心序列(图1)。据此序列设计巢式RACE PCR引物，分别克隆得到1081 bp的3′RACE产物和236 bp的5′RACE产物(图1)。将所测得的序列片段用DNAstar软件进行拼接，最终得到鲈鱼ZnT基因cDNA全长序列1747 bp。该序列5′非翻译区为84 bp，3′非翻译区490 bp，开放阅读框1173 bp，可编码390个氨基酸，典型加尾信号AATAAA位于1701～1706 bp处(图2)。

在线软件http://ca.expasy.org/tools/分析鲈鱼ZnT蛋白序列得到其分子量为43.12 kDa，等电点为6.36。用跨膜蛋白分析软件TMHMM Server v. 2.0对ZnT氨基酸序列分析表明，鲈鱼ZnT蛋白N端和C端均位于胞内，之间存在6个跨膜区(I ～VI)，每个跨膜区的氨基酸位置和数目见图2。其中第IV和第V跨膜区之间的环富含组氨酸，共有26个，大多组氨酸是以 (HX)3形式存在(图2)。

NetNGlyc 1.0 Server 分析表明鲈鱼ZnT蛋白有3个潜在的糖基化位点N-45、N-59、N-181。Interproscan软件分析结果显示，鲈鱼ZnT蛋白有2个阳离子跨膜转运蛋白活性结构域(cation transmembrane transporter activity)，分别位于35-167、245-308 。图3显示的是用TOPO2 软件分析的ZnT蛋白的2D拓扑学结构 。

A—ZnT核心片段PCR； B—ZnT 3′RACE扩增； C—ZnT 5′RACE扩增； M—DNA Marker-DL2000。

图2 鲈鱼ZnT全长cDNA序列及其编码的氨基酸

下划线表示跨膜区域；星号为终止密码子；方框指加尾信号。

2.2 鲈鱼ZnT基因系统发育分析和同源性比较

用软件MEGA 6.05中的临位相联法(Neighbor-joining，NJ)构建人和几种鱼ZnT1-10的系统进化树(bootstrap 1000 replicates)。结果表明(图4)，鲈鱼ZnT首先与红鳍东方鲀ZnT7聚合，然后与其它鱼类和人ZnT7成一簇，再与鱼的其他类别ZnT聚合，说明我们分离到的鲈鱼ZnT为ZnT7。将鲈鱼ZnT的氨基酸序列与与已公布的其他物种ZnT7进行相似性分析，发现与其他鱼类的氨基酸序列相似性从高到低分别为斑马鱼(Daniorerio)85.6%，大西洋鲑(Salmosalar)85.4%，红鳍东方鲀(Takifugurubripes)84.3%。与哺乳类的相似性相对略低，如人ZnT7(Homosapiens)为75.1%，与小鼠(Musmusculus)73.8%。

图3 鲈鱼ZnT蛋白的跨膜结构

图4 鲈鱼与其他物种ZnT氨基酸序列进化树

图中所用的序列号见表2。

3 讨论

ZnT家族和ZIP家族是转运锌离子中的两类重要蛋白，它们的结构特征决定了其在转运过程中转运方向的不同：ZnT家族拥有6次跨膜结构域，而ZIP 家族预测含有8次跨膜结构域；ZnT家族胞质C末端结构域比ZIP 家族成员长[2-3]。我们从鲈鱼肝脏分离到氨基酸序列分析表明，它具有6个跨膜区域，而且胞质C末端长达90个氨基酸，所以我们分离到的蛋白属于ZnT家族。

表2 本文所用到的ZnT基因序列

Note:arefersSalmosalar;brefersmusmusculus。

序列比对分析发现，我们分离到的鲈鱼ZnT氨基酸序列与 ZnT7序列有高度的相似性：斑马鱼，85.6%；大西洋鲑，85.4%；红鳍东方鲀，84.3%；人，75.1%；小鼠，73.8%。聚类分析显示鲈鱼ZnT首先与其它鱼类和人ZnT7成一簇，再与鱼的其他类别ZnT聚合，说明我们分离到的鲈鱼ZnT为ZnT7。ZnT蛋白的第IV和第V结构域之间的His富集序列使得该蛋白易于结合Zn2+，同时跨膜结构域所形成的小孔使成为Zn2+通过膜的通道[3]。另外，对植物ZnT的研究表明，如果缺失His富集序列会改变所运输底物的特异性[7-8]。我们发现，鲈鱼ZnT第IV和第V跨膜结构域之间的组氨酸高达26个，大多以(HX)3形式存在，认为该蛋白具有转运Zn2+的功能的ZnT。

哺乳动物中已发现10个ZnT家族成员有10个ZnT 1～10，其中ZnT7定位于高尔基复合体内，将中国仓鼠卵巢细胞(CHO)暴露于含锌的溶液中，会引起其在高尔基体的累积，表明ZnT7的作用是将锌从胞浆转运到高尔基体[9]。碱性磷酸酶是一种含锌的糖蛋白，以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的方式连接在质膜上，研究发现ZnT5和ZnT7对碱性磷酸酶的激活是必需的[10]。ZnT7通过参与锌离子在高尔基复合体内的聚集和含锌蛋白质的加工和组装，是维持神经系统锌稳态的重要ZnT之一[11]。ZnT7基因敲除小鼠大腿肌肉细胞其胰岛素信号途径的活性降低，ZnT7敲除小鼠对食物诱导的葡萄糖耐受表现更为敏感[12]。但是，鱼类ZnT7基因的细胞定位尚不清楚，其是否和哺乳动物一样参与胰岛素信号途径也有待进一步研究。

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Cloning and bioimformatics analysis of cDNA ZnT inLateolabraxjaponicus

SHU Huan-huan, ZHENG Wei-xian, QIAN Yun-xia

(Key Lab of Applied Marine Biotechnology, Minsstry of Education, School of Marine Sciences,Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Zinc transporters family plays important roles in cellular zinc storage, release and distribution. This study described the cloning and sequence analysis of the zinc transporters (ZnT) in the seabass (Lateolabraxjaponicus) using RT-PCR and SMART RACE. The acquired ZnT was 1747 bp in length, including a 84 bp 5′-UTR, a 490 bp 3′-UTR and a 1173 bp coding sequence which could code 390 amino acid. The obtained sequence was postulated to have six transmenbrane domains, an intracellular N-terminus and C-terminus and a His-rich loop between transmembrane domains IV and V. The sequence alignment analysis indicated that the obtained amino acid sequence of ZnT shared high identity with ZnT7s of other species:Daniorerio, 85.6%;Salmosalar, 85.4%;Takifugurubripes, 84.3%;Homosapiens, 75.1%;Musmusculus73.8%. Phylogenetic analysis indicated that the acquired ZnT was first clustered with ZnT7 of teleost and human, then clusterd with other type ZnT of teleost, which showed that the obtained ZnT was type ZnT7.

Lateolabraxjaponicus;ZnT; cloning

2014-05-20；

2014-07-03

浙江省科技厅创新团队项目(2010R50029)

舒欢欢，硕士研究生, 主要从事水产动物生物化学与分子生物学研究；

钱云霞，教授，主要从事鱼类免疫与营养的研究，E-mail: qianyunxia@nbu.edu.cn。

S965.211,Q343

A

2095-1736(2015)01-0006-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.006