黄芩苷对ApoE基因敲除小鼠早期动脉粥样斑块中MMP-9表达的影响*

刘小军 万招飞 王新宏 赵 娜 袁祖贻

西安交通大学医学院第一附属医院心内科(西安710061)

·论著·基础研究·

黄芩苷对ApoE基因敲除小鼠早期动脉粥样斑块中MMP-9表达的影响*

刘小军 万招飞 王新宏△赵 娜▲袁祖贻#

西安交通大学医学院第一附属医院心内科(西安710061)

目的： 探讨黄芩苷对ApoE基因敲除小鼠早期动脉粥样斑块中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响。方法： 24只8周龄ApoE -/-小鼠均给予高脂饲料喂养8周后随机分为对照组、苷低剂量和高剂量组，每组8只。灌胃8周后处死，酶法检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度；用ELISA测血清中MMP-9的表达水平;通过RT-PCR和 Western blot检测小鼠主动脉斑块组织中MMP-9的表达情况。结果： 与对照组相比，干预组小鼠血清中TC水平降低(P<0.05), 血清中LDL-C水平明显降低(P<0.01)，高剂量组较低剂量组降低的明显(P<0.05)；各组小鼠血清中HDL-C及TG含量虽有变化但无统计学意义。黄芩苷干预组血清MMP-9较对照组表达水平低，高剂量组降低更显著(P<0.05)；同时，黄芩苷干预组主动脉斑块中MMP-9 mRNA及蛋白水平较对照组降低明显(P<0.01)，高剂量组降低尤为显著(P<0.05)。结论： 黄芩苷可以降低ApoE -/-小鼠血清中血脂和MMP-9水平，并可降低动脉粥样硬化斑块中MMP-9表达，提示黄芩苷具有稳定动脉粥样硬化斑块作用。

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种以脂质聚集和炎性细胞浸润为特征的慢性炎症过程，动脉粥样硬化斑块不稳定或破裂可导致急性心脑血管事件如心梗、卒中等的发生[1]。基质金属蛋白酶作为一类可以降解细胞外基质的蛋白酶，参与血管管壁基质的降解，促使炎性细胞浸润及斑块的不稳定[2]。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是基质金属蛋白酶重要成员之一，与As 斑块稳定性尤为相关[3,4]。黄芩作为传统中药，在心血管疾病中有很重要的药用价值。黄芩苷(Baicalin)是由黄芩干燥根中提取一种黄酮类化合物，是黄芩的主要有效成分之一。既往研究发现黄芩苷具抗氧化、抑制血管平滑肌细胞增殖、抗炎等作用[5～8]。本研究以apoE -/-小鼠为动物模型，观察黄芩苷对血清中及主动脉斑块MMP-9表达的影响，探讨黄芩苷在稳定AS早期动脉粥样硬化斑块中的作用。

材料和方法

1 药品和仪器 黄芩苷：四川广汉植化公司，相对分子质量446，纯度98.5%，用生理盐水配制成 25 mg/ml，加1mol/ml NaOH调节pH值到7.3～7.4于密闭棕色容器中储存。甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)生化试剂盒(浙江东鸥生物工程有限公司)；RNA提取试剂 Trizol购自Invitrongen公司Step One Real-Time PCR System 美国ABI公司，Revert Aid First Strand cDNA Synthesisi Kit逆转录试剂盒为Fermentas公司，SYBRGreen购自Roche公司；MMP-9兔抗鼠一抗及MMP-9 ELESLL试剂盒均为(Santa Cruz Biotechnology公司)，HRP-山羊抗兔 IgG(北京中杉金桥生物技术公司)。

2 实验动物分组及给药方式 24只C57BL/6J遗传背景的ApoE -/-小鼠，8周龄，体重20±1.5g，雄性，购自中国南京大学模式动物遗传研究中心，所有动物均饲养于西安交通大学医学院实验动物中心层流室(sPF级屏障环境)。高脂喂养8周后,随机分为3组，即对照组、黄芩苷低剂量组和高剂量组，每组8只。黄芩苷低剂量组和高剂量组分别给予25、 50mg/kg·d黄芩苷，对照组则给予生理盐水。每天定时灌胃1次，连续灌胃周期8w。

3 标本制备 每组小鼠空腹过夜，晨起摘除眼球采4℃ 3000r离心10min分离血清储存于-80℃待检。采血后迅速开胸，右心耳行小切口，左室插管，用无菌冰生理盐水灌注循环，直至灌洗液清亮，直视下分离主动脉根部。予-80℃储藏的主动脉组织。

4 血脂测定 根据血脂测定试剂盒说明书步骤测血清TG、TC、LDL-C和HDL-C浓度。

5 血清中MMP-9检测 应用双抗体夹心ELESLL试剂盒法检测血浆MMP-9,具体操作按试剂盒操作说明进行。

6 Real-time PCR 检测MMP-9的mRNA表达水平 Trizol法提取-80℃储藏的主动脉组织 mRNA，紫外分光光度法测定核酸的纯度与浓度。将提取的RNA逆转录。根据MMP-9、β-actin基因序列设计引物， MMP-9上下游引物分别为： (forward), 5-AAG GAT GGT CTA CTG GCA C-3;(reverse) 5-AGA GAT TCT CAC TGG GGC-3, 产物长度279 bp), β-actin 作为内参其上下游引物分别为： (forward), 5-TCA TGA AGT GTG ACG TTG AC-3; (reverse) 5-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GC-3, 产物长度285 bp)。扩增反应条件：95℃4min预变性；95℃20s，60℃30s，72℃1min，最后72℃延伸5min，共40个循环。每份标本做复孔。取各组PCR产物 10μl，经 2%琼脂糖凝胶电泳80V 电压电泳 35min，凝胶成像仪摄像,计算目标条带灰度，并以β- actinn 的灰度作为标准对比。

7 Western blot检测主动脉中MMP-9的蛋白表达水平 取相同部位等量主动脉组织用含PMSF 的RIPA 裂解液在冰上裂解，4℃15000rmin离心5min；取上清液以BCA法测蛋白浓度；取等量蛋白与样本缓冲液混合煮沸5min后，进行SDS-PAGE电泳后电转移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h ,TBST洗膜,分别加入兔抗鼠MMP-9一抗(1∶500)4℃孵育过夜，TBST洗涤3次 每次15min 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶1500)置室温显色1h,TBST洗膜3次，进行化学发光反应，应用冷CCD照相机直接拍摄化学发光膜，Quality One 软件(Bio-Rad)分析目标带的累积光密度值(IOD)，并与内参β-actin 比较。

结 果

1 血清血脂含量变化 见表1。 小鼠在给予黄芩苷干预8周后与对照组相比，干预组小鼠血清中总胆固醇水平降低(P<0.05), 血清中低密度脂蛋白水平明显降低(P<0.01)，黄芩苷高剂量组较低剂量组降低的明显(P<0.05)；黄芩苷干预组血清中高密度脂蛋白及甘油三酯含量虽有变化但无统计学意义。

表1 各组小鼠血脂水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与对照组比较，**P<0.01;与黄芩苷低剂量组比较，#P<0.05

2 黄芩苷对血清中MMP-9水平的影响 见表2。 在给予黄芩苷干预8周后，干预组小鼠血清中MMP-9表达均明显低于对照组(P<0. 01)，其中黄芩苷高剂量组较低剂量组的MMP- 9表达低(P<0. 05)。

表2 各组小鼠血清中MMP-9的比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与黄芩苷低剂量组比较，#P<0.05

3 黄芩苷对ApoE -/-小鼠主动脉组织中MMP-9mRNA的影响 在黄芩苷高、低剂量组小鼠主动脉组织中MMP-9mRNA的表达较对照组相比减少(P< 0. 01)，且高剂量组MMP- 9mRNA的表达低于低剂量组(P<0. 05)。

4 黄芩苷对主动脉MMP-9蛋白表达的影响 在给予不同剂量黄芩苷干预8周后，无论高剂量组还是低剂量组的小鼠主动脉MMP-9蛋白表达均明显低于对照组(P<0. 01)，其中高剂量组 MMP- 9蛋白的表达比低剂量组低(P<0. 05)。

讨 论

AS斑块的不稳定或破裂是导致脑卒中和急性冠状动脉综合征的主要发病机制[1]。所以对AS 易损斑块的干预对预防急性心脑血管事件有重要意义。动脉粥样硬化斑块主要是纤维帽及脂质核构成，纤维帽的厚度和脂质核心的大小是决定斑块稳定性的重要因素。通过抑制脂质向内皮下聚集及对保持纤维帽一定厚度对维持AS斑块稳定具有重要作用。

MMP-9作为基质金属蛋白酶重要成员之一，主要降解细胞外型胶原和弹力纤维。在AS斑块中，MMP-9主要由巨噬细胞等炎性细胞所分泌，它可降解细胞外胶原及弹性蛋白，从而利于炎性细胞向内皮下浸润，加速As进程，同时导致原有斑块的纤维帽变薄、甚至崩解，以致斑块破裂。多项研究表明，在外周血及动脉斑块中MMP-9的高表达与AS斑块稳定性相关，是导致斑块不稳定的主要因素之一[9,10]。

黄芩苷(Baicalin)是从唇形科植物黄芩( Scutel laria baicalensis georigi)的干燥根中提取的一种黄酮类化合物。现代医学研究表明：其具有抗炎、抗氧化、抑制平滑肌细胞增殖、降脂等作用，是通过抑制炎性因子分泌、促使如超氧化物歧化酶、抗过氧化氢酶、谷胱苷肽过氧化物酶等抗氧化的相关酶表达增高等发挥作用。杨伟忠等发现在大鼠永久性大脑中动脉阻塞动物模型中，黄芩苷通过抑制MMP-9表达，改善脑神经损害，然而有关黄芩苷对在动脉粥样硬化斑块中MMP-9表达的影响少有报道。

我们以ApoE -/-小鼠作为研究对象，通过给予不同剂量黄芩苷干预，发现黄芩苷组较对照组小鼠主动脉及血清中MMP-9表达减低，同时血清中胆固醇及低密度脂蛋白降低，均具有统计学意义。故本研究表明黄芩苷可以降低ApoE基因敲除小鼠血清中血脂和MMP-9水平，并可降低动脉粥样硬化斑块中MMP-9表达。这可能是黄芩苷稳定动脉粥样硬化斑块、抗动脉粥样硬化作用机制之一。

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(收稿：2014-10-30)

Effects of Baicalin on the expression of Matrix Metalloproteinases-9 at early stage of atherosclerosis in Apolipoprotein E knockout mice

University(Xi’an 710061) Liu XiaojunWan ZhaofeiWang Xinhong et al

Department of Cardiovasology，the First Affiliated Hospital Medical School of Xi’an Jiao tong

Objective： To explore the effects of Baicalin on the expression of MMP-9 at early stage of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice(ApoE -/- ). Methods： Male 8-week-old ApoE-/- mice fed with high fat diet for 8 weeks were randomly divided into three groups (n=8 each) : control group, low-dose Baicalin treated group, high-dose Baicalin treated group. All the animals were fed for 8 weeks．After administered for 8 weeks, mice were sacrificed．serum TG、TC、LDL-C and HDL-C was measured. The serum MMP-9 concentration was measured by ELISA. The expression of aortic MMP-9 mRNA and protein in each group mice were determined by Real-time PCR and Western blot respectively．Results： Compared with control group, serum TC level in Baicalin treated groups were reduced (P<0.05), serum LDL-C level in Baicalin treated groups were reduced obviously (P<0.01), especially in high-dose Baicalin (P< 0.05),but The serum TG、HDL-C level did not have significant differences between groups. The level of serum MMP-9 in the Baicalin treated groups was lower than that in the control group, significantly in high-dose Baicalin (P<0.05). Meanwhile, the expression of aortic MMP-9 mRNA and protein detected by Real-time PCR and Western blot, decreased in Baicalin treated groups compared with that in control group (P< 0.01), which in the high-dose Baicalin treated group were reduced more (P< 0.05). Conclusion：The serum level of Lipids and MMP-9 in ApoE -/- mice and the expression of MMP-9 in aortic atherosclerotic plaque are reduced by Baicalin, which it shows has regulation function on stability of the plaque．

Arteriosclerosis Triglycerides @Scutellaria baicalensis Animals,laboratory Mice

*国家自然科学基金项目(81025002)

动脉硬化 甘油三酯类 @黄芩苷 动物，实验 小鼠

R543

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.04.001

△西安交通大学医学院第二附属医院心内科

▲陕西省人民医院心内一科

#通讯作者