高脂微藻的选育研究进展

摘 要:生物柴油具备与石油柴油相近的性能,最近作为一种可再生的替代能源受到人们的普遍关注。用藻类生产生物燃料可以保持碳平衡,而且进行生产时可利用相对小而贫瘠的荒地,不与农争地。因此,藻类是用来生产生物柴油的最佳原料。本文从野外采集分离筛选、优化培养、基因工程构建高脂微藻三个方面对高脂微藻的选育的国内外进展进行了介绍,并对构建工程微藻过程中面临的问题和应采取的对策进行了综述和展望。

文献标识码: A

文章编号:1005-2992(2015)04-0047-05

生物柴油是一种清洁的可再生能源,它是以大豆和油菜籽等油料作物、油棕和黄连木等油料林木果实、工程微藻等油料水生植物以及动物油脂、废餐饮油等为原料制成的液体燃料,是优质的石油柴油代用品。目前通过植物作物和动物油脂生产的生物柴油总计只能满足运输用油的0. 3%。Chisti通过建立数学模型和工程计算得出目前来自于作物生产生物柴油取代石化油是不可能的,他指出,唯一可能取代石化油的生物柴油只能是来自于微藻的生物柴油。

微藻生物柴油成套技术涵盖多个技术环节,是一个复杂的系统工程,包括通过对微藻的筛选和培育以获得性状优良的高含油量藻种,而后在光生物反应器中吸收阳光、CO 2等以生成微藻生物质,最后经过采收、加工,转化为微藻生物柴油。优良富油藻种的选育是微藻生产生物柴油效率提高与成本降低的关键,涉及微藻含油量、光合效率、生长速率等的研究,其影响因素包括微藻种类、温度、pH值、盐碱度、光照等环境因子,N、Si、P、S和微量元素等营养因子,以及基因工程改造等。选育时需要满足油脂含量高、生长速度快、油脂组成品质好的要求。其次要易于培养、抗污染能力强、营养要求低、易于采集加工等条件。筛选高脂微藻通常有野外采集分离筛选、优化培养、应用基因工程技术构建高油脂工程微藻几种途径,以下一一详述。

1　野外采集分离筛选

野外采集分离筛选是指从野外采集分离,进而筛选出有产油潜力的株系的一种方法。美国能源部自1978年开始立项利用藻类制备生物柴油的研发工作,从海洋和湖泊中分离了3 000多种藻类,从中筛选出300多种生长快、含油高的硅藻、绿藻和蓝藻等藻种。绿藻属含油脂量可达22. 5%,硅藻属含油脂量可达22. 7%,蓝藻属含油脂量可达9. 8%。在胁迫条件下(光胁迫、营养胁迫),绿藻属含油脂量可达45. 7%,硅藻属含油脂量可达44. 6%,蓝藻属含油脂量可达44. 6%。而鲜见关于高油脂蓝藻(原核微藻)的报道。这可能是因为蓝藻大多不以油脂方式储存能量,很难在生物柴油合成领域被利用。而硅藻和绿藻中碳则多以油脂的形式储存,经过比较简单的酯交换反应就能转化为生物柴油 [1]。

收稿日期:2015-05-26

作者简介:赵晴潇(1980-),女,吉林省吉林市人.东北电力大学化学工程学院高级实验师,主要研究方向:破骨细胞分化发育.

近年来,中国海洋大学构建的海洋藻类种质资源库,已收集了600余株海洋藻类种质资源,目前保存有油脂含量接近70%的微藻品种。以中国科学院各研究所为代表的相关研究机构在藻种的筛选领域已开展了大量的工作,目前筛选出富油富烃微藻66株。从筛选结果来看,尽管野生型藻株性状稳定,但在光合效率、生长速度以及抗逆性和能量产出等方面仍无法满足工业化生产的需要,相关性状有待进一步提高。

2　优化培养

优化培养是指以现有的代谢体系为基础,通过创造一种生理压力来调整代谢流适当向油脂合成方向转换,是从生理生化水平对微藻进行代谢调控来增加油脂总产量的方法。通过对碳源、氮源、磷源、铁离子、硅等的种类或供应量的优化,摸索出有利于微藻产油的营养条件。

2.1 碳源对油脂含量的影响

Chiu等研究了CO 2浓度对微绿球藻的生长和脂质积累的影响,发现通入2%CO 2与通入空气相比,通入2%CO 2可以提高微绿球藻的生长速率和生物量,而更高浓度的CO 2则会抑制微绿球藻的生长。他们对指数期、稳定期早期和稳定期的微藻细胞进行脂质含量的测定时发现,脂质含量分别占干重的30. 8%,39. 7%和50. 4% [2]。

2.2 氮源对油脂含量的影响

许多实验己经证明氮缺乏最容易刺激微藻油脂尤其是三酸甘油的积累。Yanna Liang等通过对Chlorella vulgaris抑氮培养,藻细胞脂质含量由33%增加到38%。黄建忠等 [3]发现NH 4NO 3、尿素等适合细胞生长但不适合油脂合成;蛋白胨、牛肉膏不适合细胞生长但利于油脂合成;酵母膏不仅适宜细胞生长,也是油脂合成的最佳氮源。Li等 [4]研究了氮源种类和浓度对Neochloris oleoabundans细胞生长和脂积累的影响,硝酸盐、氨、尿素是最普遍的氮源形式,其中NaNO 3是该藻生长和脂积累的最适氮源。

2.3 磷源对油脂含量的影响

磷对细胞能量的生物转化相关过程(如光合磷酸化)非常重要,光合作用需大量蛋白,蛋白合成需要富含磷的核糖体,磷胁迫使光合作用受限,细胞代谢将倾向于脂合成转化,油脂积累。

2.4 其他条件对油脂含量的影响

铁离子对微藻的生长和脂质的积累存在影响,如Liu等发现当小球藻生长达到对数生长末期时加入铁离子可以延长对数生长期,进而增大生物量。将培养到对数末期的小球藻收集后接种到含有不同浓度铁离子浓度的新鲜培养基中后,细胞中脂质含量有了不同程度的升高,当铁离子浓度达到1. 2×10 25mol / L时脂质的含量达到了干重的56. 6%是其他含有低铁离子浓度培养基的3 -7倍 [5]。Rao等对产烃葡萄藻的研究发现不同的盐度对微藻的总脂含量产生不同程度的影响 [6]。Takagi等在高盐条件下培养Dunaliella,当初始盐浓度从0. 5 M增至1M时,含油量由60%增至67% ;当初始盐浓度为1M,并在对数期中期或末期加入0. 5 M或1 M盐时,含油量可增至70% [7]。

从上文中可以看出,在胁迫条件下脂质含量会相对增加。但是也有人指出,在缺乏氮源、硅源等必要营养元素的条件下,虽然脂质含量相对增加,但是在这种培养条件下微藻的生物量会大大减小,并不能达到增产的目的。大部分微藻细胞大量积累油脂发生在细胞分裂受阻或抑制,而碳继续被细胞固定同化的情况下(如氮短缺等逆境条件),此时细胞含油率迅速增长但细胞数目增长缓慢(如处于稳定期的微藻),这致使总生物量增长减缓进而制约了总油脂生产量的提高。微藻产油脂可分为两个阶段,即藻体增殖期和油脂积累期,这两个阶段对营养盐要求不同。细胞增殖期是微藻消耗培养基中的氮源,吸收利用蛋白质,以保证藻体代谢旺盛;当藻体细胞增殖率剧增,以消耗碳、氮源为主,并合成积累大量油脂。因此,培养前期宜采用完全培养使细胞快速生长获取大量藻体,产油阶段宜采用营养盐限制以积累更多脂肪。

在我国最早从事微藻生物柴油研究工作的是清华大学吴庆余课题组。他们通过调整碳、氮源的供给,获得异养小球藻细胞,该细胞不含叶绿素,蛋白质含量非常低,而粗脂肪含量却比自养藻提高了3. 4倍。研究结果表明,异养藻细胞热解饱和烃气的产率是自养藻细胞的32倍。他们利用高脂肪含量的异养藻快速热解获得57. 2%的产油率,比自养藻产油率提高了2. 4倍。获得了与化石燃油相当的优质生物质燃油,热值分别是木材热解油和自养藻热解油的2和1. 4倍,这种热解油具有化石燃油的相关特征(密度0. 864 kg·L -1,粘度5. 2×10 -4(40℃),热值41 MJ·kg -1)。藻类的异养生长,不仅可提高细胞内脂类的含量,而且也是提高其生物量的有效途径。这种培养方式避免了光自养培养过程中光抑制或光限制等问题,降低了能耗,节约了成本,为工业化大规模高密度培养微藻奠定了基础。目前,异养培养微藻生产生物柴油存在两个主要问题:一是失去了光自养培养微藻生产生物柴油的五大优点(如不仅不能固定CO 2反而会排放出CO 2等);二是成本高(以葡萄糖为碳源,每生长1吨小球藻所需的碳源成本约9 000元)且难以和产油微生物竞争。

3　应用基因工程技术构建高油脂工程微藻

基因工程法增油脂是指通过对微藻油脂合成相关途径关键基因的操作,从分子水平化解高生长率和高含油率之间的矛盾,以构建出能够快速积累油脂的工程微藻藻株。为提高微藻产油能力,对微藻的改造至少可从以下三方面进行:一是加快微藻的生长速度;二是提高微藻的光合效率;三是增加微藻含油量。目前,研究者主要通过两个方面的基因操作来提升油脂合成能力:(1)超表达与油脂合成直接或间接相关的关键酶;(2)阻断与油脂合成途径竞争中间代谢物的其他途径的关键酶。

3.1 超表达与油脂合成直接或间接相关的关键酶

3. 1. 1 乙酰辅酶A羧化酶研究

脂肪酸的生物合成是以乙酰辅酶A为底物,经乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase, ACCase)的催化,开始脂肪酸的合成。ACCase是脂肪酸生物合成途径的关键限速酶。高等植物有关ACCase调控脂类合成的研究表明,高等植物中ACCase的活性高低直接影响脂肪酸的生物合成。美国再生能源国家实验室(NationalRenewable Energy Laboratory,NREL)于1991年开展了有关基因工程构建高油微藻的工作。并于1995年将ACCase基因转化小环藻成功 [9,10]。在实验室条件下可使“工程微藻”中油脂含量增加到60%以上,户外生产也可增加到40%以上,而一般自然状态下微藻的脂质含量为5% -20%。预计每平方米“工程微藻”每年可生产约116 L柴油。目前,他们正在研究选择合适的分子载体,使ACC基因在细菌、酵母和植物中充分表达,进一步将修饰的ACC基因引入微藻中以获得更高效表达。天津科技大学正在开展ACCase调控微藻脂肪酸合成能力的研究,目前正在筛选转化ACC基因的丝状体微藻 [11]。

3. 1. 2 苹果酸酶研究

苹果酸酶催化苹果酸转化为丙酮酸并同时将NADP +还原为NADPH,研究发现超表达苹果酸酶而增多的NADPH供应会被甘油三酯合成途径有效利用并导致油脂产量的上升 [12]。Zhang等以卷枝毛霉(Mucor circinelloides)为模型,利用基因工程方法成功实现对苹果酸酶的过量表达,使其脂肪的合成提高了2. 5倍 [13]。

3. 1. 3 3-磷酸甘油脱氢酶研究

甘油三酯合成的另外一个前体物质为甘油-3-磷酸。磷酸二羟丙酮在3-磷酸甘油脱氢酶的催化下可以生成甘油-3磷酸,所以3-磷酸甘油脱氢酶被认为是调控甘油三酯积累的关键酶之一。在甘蓝型油菜中过表达3-磷酸甘油脱氢酶,种子的甘油-3磷酸含量提高了3 -4倍,油脂含量提高了40%。

3. 1. 4 二酯酰甘油酰基转移酶研究

二酯酰甘油酰基转移酶(DGAT)催化甘油三酯合成的最后一步反应。DGAT的底物二酯酰甘油既可以分配到磷脂合成途径,亦可以分配到TAG合成途径,超表达DGAT可以使更多的二酯酰甘油分配到TAG合成途径中而不是形成磷脂 [14]。高等植物DGAT高效表达除了可增加脂生物合成速率,也可促进脂肪酸形成。拟南芥、酵母及烟草中超表达DGAT皆使TAG含量大幅提升,但该酶在微藻中高效表达的研究尚未见报道。

3.2 阻断油脂合成的竞争途径

3. 2. 1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶研究

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)存在于所有光合生物中,是光合作用过程中的关键酶,同时还参与了氨基酸代谢途径中碳骨架的回补作用等。对脂类代谢而言, ACCase和PEPC共同调控脂类代谢途径的方向。当丙酮酸合成后,ACCase催化底物乙酸辅酶A进入脂肪酸合成途径;乙酸辅酶A的浓度累积激活PEPC,催化丙酮酸合成草酸乙酸进入氨基酸生物合成途径。因此,抑制PEPC的活性有助于促进ACCase催化底物合成脂肪酸。侯李君等通过将蓝藻正反义pepcA基因导入对大肠杆菌中脂类合成的调控的研究发现:转反义pepcA片段E. coli中PEPC酶活性降低到野生菌的0. 2%,蛋白质合成减少23. 6%,脂类合成增加了46. 9%;而转正义pepcA片段E. coli PEPC酶活性是野生菌的2. 38倍,蛋白质合成增加了14. 5%,脂类合成减少了49. 6% ;转基因菌中十八碳酸的含量明显增加 [15]。目前天津科技大学正在正在开展反义技术调控微藻PEPC代谢途径的工作,其初步结果已表明,反义抑制PEPC酶活性可显著提高藻细胞脂类含量。2005年,赵桂兰等用农杆菌介导法将反义PEPC基因导入大豆的基因组,获得了稳定的超高油转基因大豆品系。

3. 2. 2 B2氧化途径

B2氧化是真核细胞中脂肪酸降解的主要代谢途径,它会消耗细胞内的脂肪酸,而脂肪酸是甘油三酯合成的前体,因此,通过阻断这条途径有可能提高甘油三酯的产量。Cao等研究表明部分阻断B2氧化能促进假丝酵母的二羧酸(一种短链脂肪酸)生产,然而完全阻断转运系统则会对细胞的能量供应有害 [16];Picataggio等的实验结果与之相符 [17]。

3. 2. 3 淀粉合成途径

此外,在真核藻类细胞中,淀粉也是一类主要的能量储存物质,有些研究通过阻断淀粉的积累来打破细胞内能量分配,促进脂肪的积累。衣藻的两个淀粉合成受阻突变株sta6和sta7,在限氮培养条件下,甘油三酯的积累都提高。小球藻的无淀粉型突变株中多不饱和脂肪酸的含量也提高了4倍 [18]。

国内关于微藻基因工程的研究在最近十年中发展较快。我国从1998年国家启动海洋“863”计划后,参与的人员和获得的成果增长速度明显超过国外,成为国际上在藻类基因中表达外源基因最多的国家。采用基因工程手段,培育出遗传稳定、生长迅速的微藻产油株系,以此为基础构建起较为简单的培养流程并因而降低生产成本,这是促使微藻生物柴油迅速工业化生产的最关键问题。虽然通过基因工程法促使微藻大量生产油脂尚未成功,但是油料作物如大豆、油菜中的成功案例使我们看到了希望。

4　展 望

目前微藻基因工程在技术水平上至少有三个问题需要解决:一是发现相关基因;二是寻找合适的载体;三是提高外源基因在藻类中的表达效率。另一方面,快速的生长条件也是降低微藻生物柴油开发成本的必然要求,即选育和基因工程改造后要符合耐高浓度的CO 2、高温以及高强度光照的条件。由于空气中的CO 2只有0. 03% -0. 06%,而环境中一定浓度的CO 2含量又是微藻快速生长的基本条件,因此工业废气等非自然条件下的环境就成为了常见的选择。目前,已有较多的研究者对微藻生长条件进行了研究,部分微藻分别在耐受的CO 2浓度、耐受温度以及产率等方面表现出较好的特性。

采用基因工程控制关键酶表达来调控油脂的方法,经常会遇到一个问题:即使关键酶在受体细胞中高效表达,但油脂含量并没有增加,这说明在油脂合成路径中可能存在多个限制点,而基因工程只提高了其中一个。针对这一问题,有学者提出同时高效表达多个关键酶基因的想法,但由于多基因操作难度很大,这方面的报道也很少见。最近,又有学者认为调控代谢应基于整个细胞水平,而非单一路径水平,提出了转录因子工程方法(transcription factor engneering approaches,TFE)这一新概念。转录因子是指通过被特定DNA序列识别并建立蛋白-DNA、蛋白-蛋白相互作用来调控DNA转录的蛋白。基因工程影响一个基因,而转录因子影响多个代谢路径的大量基因,进而使多个代谢路径同时作用来综合调控目的产物的生物合成,因此TFE被认为是一种很有潜力的新兴技术。目前该方法在动物、植物、微生物中已有初步研究。在微藻产油方面则刚刚开始,首先需要深入了解微藻转录因子的生理功能以及确定不同微藻中调节油脂合成路径的转录因子 [19-20]。

参 考 文 献

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Recent Advancesin Screening High Lipid Productivity Microalgae

ZHAO Qing-xiao 1,CHEN Xue-mei 1,MA Lin 2

(1. School of Chemical Engineering Northeast Dianli University,Jilin Jilin 132012;2. China Petroleum Jilin Petrochemical Chemical Power Plant,Jilin Jilin 132022)

Abstract: Recently, biodiesel receive extensive attention as a renewable and environmentally friendly alternative energy source due to the similar performance with fossil fuel and conventional fossil fuels shortage. When algae are utilized for biofuel production,the carbon balance is keeped and the agriculture land is saved. Therefore,algae are the best material for biodiesel production. In this paper,we try to introduce the domestic and international progress of high-lipid microalgal screening from three aspects:isolation and screening algae from the nature,optimization of culture and genetic engineering in regulation of lipid metabolism. The problems in the construct of genetic microalgae strains are also discussed in this review.

Key words: Biodiesel;Algae;Genetic engineering