耐异烟肼结核杆菌基因研究概况*

杨捷 叶品良 张传涛 曾萍 卢润生

（成都中医药大学·610075）

肺结核依然是当今世界性难题之一，其难以被攻克的原因是由于结核杆菌易产生耐药性而对诊断以及治疗造成困难。20世纪90年代以后结核病的耐药发生率的逐渐上升，使其已成为全球结核病急剧上升的重要原因之一[1]。我国总耐药率为27.8%，其中大部分患者为耐多药者，且更趋向于对主要一线抗结核药物的耐药，其中尤以对异烟肼和利福平的耐药率较高，分别为17.6%和16.6%，属高耐药国家，这也是造成结核病治疗失败的重要原因之一[2]。

异烟肼（INH）作为结核病化疗最强的一线药物，必须重视对其耐药性的研究。国外有报道认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是和过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关[3]，而KatG的活化为结核分枝杆菌的杀菌形式，也就是要在过氧化氢酶-过氧化物酶的作用下使其转化为活性形式，而KatG基因发生突变或缺失，则异烟肼活化效率降低或不能活化，导致结核分枝杆菌对异烟肼发生不同程度的耐药[4]。国内在1992年也有了相关的报到，Zhang等[5]发现异烟肼的耐药性与KatG基因变异相关。近年来又有研究发现还有其他机制参与异烟肼耐药，比如与inhA等基因的突变也有相关性。

1 耐异烟肼结核杆菌基因研究

由于结核菌比一般的细菌生长都要缓慢，一旦经过抗结核治疗后的结核菌生长更缓慢，通常需要数周才能生长。所以如何快速敏感的检测结核分支杆菌耐异烟肼基因上，相关专业人员建立了等位特异多聚酶链反应。也就是PCR扩增阴性的原理[6]。研究人员对结核分枝杆菌进行了一线抗结核药物的耐药性测定，结果显示耐药谱以耐异烟肼为最高[7]。对于结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究已经成为如今的较前沿的研究方向，许多研究的结果都表明耐异烟肼结核杆菌的产生可能是由于其 KatG 基因完全缺失或 KatG基因突变所致[8-10]。异烟肼作为重要的抗结核一线药物，但因其结核分支杆菌对异烟肼的耐药机制较为复杂，故近年来才在结核病研究中倍受关注。我国正处于结核病分子流行病学研究起步阶段，并且我国是全球结核病高负担国家之一，我国结核病疫情的高发为今后进一步的研究提供了很好的资源和现场[11]。

2 katG基因变异与耐异烟肼的关系

Leung等[12]报道，南方地区异烟肼的耐药株有51%存在KatG基因的315位密码子点突变，金嘉琳等[13]报道华东地区异烟肼的耐药株有高达76.9%存在KatG基因的315位密码子点突变，少数是由于katG基因的部分或全部缺失引起[14]。

KatG基因是唯一能激活异烟肼的酶，其315位点的变异在我国占50%以上，是我国最常见的基因突变形式，变异所占比例还是低于一些结核耐药高发地区，如俄罗斯[15]，与南非等地区接近[16]。KatG基因315位密码子突变可直接导致katG基因功能紊乱，这就导致了过氧化氢酶－过氧化物酶活性下降或丧失，阻止了异烟肼的活性化，从而导致结核分支杆菌对异烟肼产生不同程度的耐药［17］。研究显示KatG315突变与异烟肼耐药的浓度有关，结核分支杆菌异烟肼高浓度耐药菌株的KatG315突变率显著高于异烟肼低浓度的耐药菌株。同时研究显示KatG315突变的结核分支杆菌分离株可能更容易获得对其他抗结核药的额外耐药[18]。

KatG基因第463位点突变存在于20%～45%耐药株中，但是多项研究已经证实该突变与基因多态性相关，与异烟肼耐药无关[12]。KatG基因除了广泛被报到的314、463位点外，新发现突变频率较高的还有A234G突变，但这个位点的突变多为联合突变[12]。

3 inhA等基因突变与耐异烟肼的关系

异烟肼抑制结核分支杆菌的机制和部位尚不清楚。研究表明，最低抑菌浓度水平的异烟肼和乙胺丁醇可以阻断99%的分支杆菌的分支菌酸的生物合成，且具有相同的作用位点[19]。同时研究证实结核分支杆菌耐异烟肼和乙胺丁醇的特性与inhA突变导致药物结合位点减少有关[20]。也有研究证实了结核分枝杆菌KatG和inhA基因突变与耐异烟肼有关，并且发现了2个新的katG基因突变位点(Val230Met 和Pro232Gln)，为进一步研究异烟肼的抗菌机制奠定了基础[21]。

4 耐异烟肼结核分支杆菌的测定方法

PCR-DNA测序技术方法敏感、准确、特异，可快速检测结核分枝杆菌KatG耐药基因突变，有利于耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性的快速检测[22]。多数结核分支杆菌耐异烟肼是由于其 KatG 基因突变或缺失所致，PCR-SSCP方法敏感、特异，可快速检测结核分支杆菌KatG基因突变或缺失[23]，用其筛选突变株也可达到快速检测结核分支杆菌异烟肼耐药的目的[24]。荧光PCR探针熔解曲线法检测速度快速、特异性强、灵敏度较高，可用于结核分枝杆菌耐异烟肼突变的快速检测，适于耐多药结核病的快速筛查[25]。快速检测耐利福平与异烟肼结核分枝杆菌KatG、inhA基因突变的DNA芯片具有较高的特异性和敏感性，可用于临床结核分枝杆菌耐药性检测[26-27]。MAS-PCR方法有较高的敏感性及特异性，检测 KatG基因315位点的突变以间接判断对异烟肼的耐药性[28-29]。

5 耐异烟肼肺结核临床研究进展：

因为异烟肼的问世，并且广泛的应用以来，使得肺结核的治疗进入了化疗时代，也使得异烟肼成为了最重要的一线抗结核药物[30]。但是由于耐药性结核病发生率的逐年升高，使得化疗进入了一个联合用药的阶段。同时也有对耐异烟肼、耐利福平结核病的治疗，治疗效果虽好，但治疗方案花费较高[31]。6种抗结核药物的耐药率中最高为异烟肼(17.6%)、最低为氨硫脲(1.3%)。初治耐药率一般以耐链霉素为最高，耐异烟肼排其后，而获得性耐药率以耐异烟肼为最高。2000年流行病学调查中肺结核总耐药率与1984～1985年和1990年相比呈下降趋势，但耐药性的发生则更趋向于耐多种药物[32]。

6 讨论

人类对结核病控制经历了三个具有划时代意义的里程碑，目前我们正处于分子生物学技术的研究阶段[1]。研究显示结核分枝杆菌对异烟肼耐药主要与KatG和inhA基因突变有关，但具体的结构以及作用机制尚不清楚，有待未来一进步深入研究。在耐异烟肼结核分支杆菌的测定方面，我们已经能够做到快速筛查，但临床应用并不广泛，检测方法的优化及推广有待提高，以期更好的服务于临床。

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