MHP-2b免疫活性的研究

詹业奇

(江西国药有限责任公司，江西 南昌 330052)

MHP-2b免疫活性的研究

詹业奇

(江西国药有限责任公司，江西 南昌 330052)

目的：研究蝙蝠蛾被孢霉多糖(MortierellahepialiPolysaccharides，MHP)其中一个组分MHP-2b的免疫活性。方法：体内实验：给MHP-2b组小鼠外周的白细胞，红细胞，血小板数量和骨髓DNA含量有增加(*P0.01，*P0.05，与空白组比较；P0.01，P0.05，与模型组比较)，随剂量增加增幅越大。结论：体内实验：MHP-2b能够明显的减轻环磷酰胺带来的骨髓抑制作用。

蝙蝠蛾被孢霉多糖MHP-2b白细胞 抗肿瘤 环磷酰胺

前言

多糖是生物高分子家族组成中的最丰富多彩的成员，它是由单糖多聚而成的天然高分子化合物，已知的天然多糖约有300多种，广泛存在于动物、植物和微生物组织中。近10年来，随着天然药物化学、药理学研究的不断深入及分析手段突飞猛进的发展，多糖仅作为支持组织和能量来源的传统观念已被突破[1]。近年来，大量药理及临床研究表明，多糖类药物是一种免疫调节剂，其免疫疗法给近代肿瘤、艾滋病及其他疾病的治疗开辟了新的方向，因此多糖的研究引起了国内外许多学者的极大兴趣。

本实验旨在对从虫草发酵菌丝体中提取的活性多糖的免疫活性方面进行研究。本实验为进一步将其开发为各种免疫调节剂开辟了道路，也为其后续研究工作奠定了坚实的工艺基础。

1 MHP-2b的免疫活性研究

大剂量应用环磷酰胺给小鼠腹腔注射，使其与小鼠组织细胞中功能基团如DNA、蛋白质分子中氨基、巯基、羟基等作用，发生烷化作用，造成小鼠骨髓造血机能抑制和外周血白细胞数，血小板减少。实验证明MHP-2b能够明显的减轻环磷酰胺带来的骨髓抑制作用，增加小鼠外周的白细胞，红细胞和血小板数量。起到辅助抗肿瘤药物治疗的效果。

1.1 材料、仪器和试剂

1.1.1 实验动物

健康ICR小鼠，体重20g左右，共62只，雌雄各半。普通级。

1.1.2 实验用药

虫草被孢菌粉，长兴制药有限公司；

升白安，江苏信孚药业有限公司；

环磷酰胺(cytoxan)，江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.1.3 仪器

320-S型pH计，METTLERTOLEDO公司；

电子天平BS200S，北京赛利斯天平有限公司；

752紫外光栅分光光度计，上海精密仪器厂；

LXJ2I型离心机，上海医用分析仪器厂；

RE52旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；

DZF-6020真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；

三用电热恒温水箱，北京长安科学仪器厂；

漩涡混合器，浙江东城电器厂。

1.1.4 试剂

无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸，南京化学试剂公司，分析纯。

1.2 方法

1.2.1MHP-2b的提取方法

取一定量虫草被孢菌粉，加入10倍95%乙醇(0.45uM滤膜过滤)，回流2小时脱脂，60℃烘干。称重后，加入一定量的蒸馏水，用2MNaOH调pH为8，高温提取，低速离心得上清液，残渣再重复加水提取两次，合并三次提取的上清液，用盐酸将溶液pH调至中性，减压浓缩至原体积的1/3，边搅拌边加入乙醇进行沉淀，边搅拌边加入乙醇进行分级沉淀(分级浓度分别为50%、65%、75%、85%)，静置8h，8000rpm×10min高速离心，将所得沉淀依次95%乙醇，无水乙醇洗涤，真空干燥。

1.2.2 血小板减少症模型的建立

依据新药临床前研究指导原则汇编介绍方法，分别用MHP-2b给药的第三天同时小鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg，每日1次，连续3d；造骨髓抑制模型，同时给予治疗药物MHP-2b，以升百安为阳性对照药，其中以造模组停药后3d左右下降至用药前血小板计数的20%-30%为造模成功的标准。

1.2.3 实验方法

将小鼠随即分为6组(每组10只)，分为空白组、模型组、阳性组、多糖(高、中、低)一共6组。按以下方式给药：

(1)空白对照组：生理盐水0.1ml/10g/只灌胃，每天1次；

(2)环磷酰胺骨髓抑制模型组：生理盐水0.1ml/10g/只灌胃，每天1次；

(3)阳性药组：升百安按照正常人用剂量换算，25mg/kg，生理盐水配置0.1ml/10g/只灌胃，每天1次；

(4)多糖(高剂量)组：20mg/kg，生理盐水配置0.1ml/10g/只灌胃，每天1次；

(5)多糖(中剂量)组：10mg/kg，生理盐水配置0.1ml/10g/只灌胃，每天1 次；

(6)多糖(低剂量)组：5mg/kg，生理盐水配置0.1ml/10g/只灌胃，每天1 次。

除空白组，其余各组在给药3天后按100mg/kg给药，每日1次，连续3d。每隔4天测一次体重，直至实验结束。给环磷酰胺7天后，眼眶取血，检测血液生化指标。

1.2.4 检查指标

(1)小鼠的一般状况，造模成功的一般判定。

(2)停药后第7天断头取血，进行白细胞数及分类、红细胞数、网织红细胞数、血红蛋白含量和血小板数测定。

(3)骨髓DNA含量测定：取左侧完整股骨，除净软组织，用0.005MCaCl210ml将全部骨髓充入离心管中，置4℃冰箱30min，2500转离心15min，弃上清，将沉淀物加0.2NHClO45ml充分混匀，90℃加热15min，冷却后过滤，取上清用紫外分光光度仪268nm波长处测定紫外吸收A值。

(4)体重变化与脾脏指数。

1.3 实验结果

1.3.1 对环磷酰胺(CTX)致外周血细胞减少的影响

结果表明环磷酰胺可使小鼠外周血白细胞(WBC)，红细胞(RBC)和血红蛋白(HB)明显减少。MHP-2b5mg～20mg/kg范围内能够显著的增加环磷酰胺所致的WBC、RBC、HB的减少状况，和模型组比较有显著差异。

雌雄各半组别白细胞红细胞血小板空白10.52±2.67.6±0.561622±215.2模型5.77±1.98**5.24±0.3**1252±361.1*阳性9.2±2.29DD6.79±0.41D1493±327.3D多糖高9.74±2.09DD6.83±0.24D1599±232.2D多糖中8.25±1.85DD6.87±0.35D1447±227D多糖低7.37±2.19D6.9±0.7DD1293±321.6

注：**P<0.01，*P<0.05，与空白组比较；P<0.01，P<0.05，与模型组比较。

1.3.2 对环磷酰胺(CTX)致骨髓DNA和有核细胞减少的影响

结果表明CTX可使小鼠骨髓DNA含量和有核细胞数明显减少，呈现明显的骨髓抑制作用。MHP-2b能使减少的骨髓DNA含量和有核细胞数得以显著回升，大剂量组疗效优于升白安片。

组别DNA含量有核细胞数空白1.107±0.177327.2±59.8模型0.621±0.091**167±41.2**阳性0.8±0.091DD257.1±16.8DD多糖高0.887±0.131DD268.4±98.8DD多糖中0.712±0.141D206.1±42.3D多糖低0.656±0.177192.1±48.2D

注：**P<0.01，*P<0.05，与空白组比较；P<0.01，P<0.05，与模型组比较。

1.4 结论

环磷酰胺是临床常用的治疗肿瘤药物，但其治疗后引起一系列程度不同的副反应，其中主要有骨髓抑制和免疫功能低下，造成白细胞，血小板减少症。现代医学认为，白细胞下降与骨髓造血功能衰退或障碍有直接关系。大剂量应用环磷酰胺给小鼠腹腔注射，使其与小鼠组织细胞中功能基团如DNA、蛋白质分子中氨基、巯基、羟基等作用，发生烷化作用，造成小鼠骨髓造血机能抑制和外周血白细胞数，血小板减少[2]。

研究表明MHP-2b能升高模型小鼠的白细胞数和血小板数，增加小鼠体重，能够对抗环磷酰胺所致白细胞数和血小板数的降低；MHP-2b还可以增加骨髓DNA含量，说明其对环磷酰胺所致的骨髓抑制造血功能减退有治疗作用，能够促进骨髓粒细胞增殖。以上说明MHP-2b对骨髓造血功能和外周血白细胞和血小板增殖具有促进作用，增强免疫功能，从而对骨髓抑制的模型小鼠具有明显治疗作用。这为以后临床推广应用提供了实验依据。本实验仅对MHP-2b的升白和升血小板作用作了初步的预实验研究，所用动物数量少，有关它的药理活性筛选还有待进一步探讨。

2 综述

虫草多糖(Cordyceps.Polysacchride，CP)是冬虫夏草的主要活性成分之一，具有抗肝纤维化、免疫调节、抗肿瘤[3][4][5]、降血糖等多方面的作用。本文对CP的免疫调节作用及其可能的药理机制进行综述。

(1)药理特性

其性平，味甘，入肺、肾经，具有补肺益肾、止血化痰之功效。多糖是冬虫夏草的主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗辐射作用、增强机体免疫力和降血糖等多方面药理作用，对人和动物低毒无害，对治疗肿瘤和感染所引起的免疫抑制有潜在价值。

(2)虫草多糖的免疫调节作用[6][7]

多糖是由许多单糖分子以糖苷键结合而成的天然高分子化合物，广泛存在于高等植物、动物细胞膜及微生物细胞壁中，是生命有机体不可缺少的组成部分并履行一系列不同的生理功能，其中真菌多糖因其独特的低毒而免疫活性强的生物活性而引起人们广泛的关注。在一般情况下，真菌多糖对机体特异性免疫和非特异性免疫，细胞免疫和体液免疫均有影响，但主要影响机体的网状内皮系统(RES)，巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞、NK细胞、补体系统以及RNA、DNA、蛋白质的合成[8]，体内cAMP与cGMP的含量，其结果是抗体生成，淋巴因子及干扰素的诱导生成增多[9]。作为一种生物非特异性免疫促进剂，食药用真菌多糖具有抗肿瘤、抗病毒、降血脂、影响免疫调节活性、延缓衰老、护肝排毒、促进核酸和蛋白质生物合成等多种功效[10][11]。因此真菌多糖成为一个非常活跃的研究领域。

CPS(总多糖)对CDDP诱导的MDCK，Vero细胞损伤的细胞形态的影响[6][7][12]：将处于对数生长期的MDCK，Vero细胞制成细胞悬液，以3.0×105/ml细胞浓度加入96孔细胞培养板内，每孔0.16ml，置培养箱中培养4h，待细胞贴壁后，按如下方法加入药物：CPS(总多糖)组加入20μl不同浓度的CPS(终浓度依次为12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)和20μl完全培养液，CDDP组加入20μl终浓度为2.5ug/ml的CDDP和20μl完全培养液，CPS+CDDP组加入20μl不同浓度的CPS(终浓度依次为12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)和20μl终浓度为2.5ug/ml的CDDP，空白对照组加40μl的完全培养液。放置培养箱内连续培养48h，培养结束后将细胞培养板置倒置显微镜下观察细胞形态的变化并拍照。

3 评价与展望

自1969年日本人发现一种具有抗肿瘤活性的真菌多糖而轰动医学界以来，全世界掀起了从真菌中寻找抗肿瘤成分的高潮[13]，冬虫夏草多糖的各方面研究也从此展开。在临床上可用于提高机体免疫功能，因而在抗肿瘤、抗感染和造血功能障碍等治疗中发挥作用。由于野生冬虫夏草的过度采集，同样拥有增强免疫功能的虫草被孢菌粉作为野生冬虫夏草的替代品具有较大的市场。经过更进一步的体内实验，必将为其新药开发展现良好的前景[14]。

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The studieson immunity activities of MHP-2b

ZHAN Ye-qi

(JiangxiGuoyaopharmaceuticalCo.Ltd，JiangxiNanchang330052)

Object：The main purpose of this dissertation was to study immunity activities of MHP-2b which is a part of MHP.Method：In vivo studies：The number of leukocytes，red blood cells and platelets increased which were given MHP-2b.Conclusion：In vivo studies：MHP-2b can reduce the bone marrow inhibition caused by cyclophosphamide visible.

MHP MHP-2b WBC Antineoplastic Cyclophosphamidum