软骨组织工程相关细胞因子研究新进展

莫紫贺 黄江鸿 王大平 刘国平 廖福朋

随着人口老龄化现象日益突出，临床上以软骨破坏和软骨退化为主的骨性关节炎（osteoarthritis，OA）等疾病的发病率逐年上升，已经成为一个亟需解决的公共医疗问题。据WHO 有关统计资料显示［1］，65岁以上的人群中，90%的女性和80%的男性患OA。关节软骨为无血管组织，且缺乏神经支配与营养，再加上其低代谢性和高密度的细胞外基质限制了软骨细胞向缺损的地方生长［2］，从而导致关节软骨的自我修复能力有限，一旦受到伤害就有可能导致关节软骨的逐步损伤与退化。随着软骨组织工程技术的发展，损伤软骨的完全生物再生有了新的希望。组织工程软骨的构建需要具备三个必要条件：种子细胞、细胞支架以及细胞因子。其中，细胞因子能显著促进细胞分化增殖并诱导其功能的发挥。多种细胞因子共同刺激，介导了种子细胞分化成软骨细胞的整个过程。本文就在软骨组织工程中发挥重要作用的各种细胞因子的基本情况、作用机制及作用效果作一综述。

目前研究较为深入的细胞因子主要有转化生长因子－β（transforming growth factor－beta，TGF－β）、胰岛素样生长因子（insulin－like growth factor，IGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、血小板源性生长因子（platelet－derived growth factor，PDGF）、软骨源性形态发生蛋白（cartilage－derived morphogenetic protein，CDMP）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。

一、转化生长因子－β（TGF－β）

作为最重要的软骨诱导因子之一，TGF－β是一种对细胞增殖和分化有重要调节作用的细胞因子。TGF－β由2个亚单位以二硫键的形式连接而成，分子量为12．5 kD，被发现广泛存在于正常组织中，其中以骨组织和血小板中的含量最为丰富。其作用机制主要有调节内分泌、自分泌和旁分泌等，对纤维化疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等多种疾病起重要调节作用［3］。

TGF－β主要有四种存在形式。经研究发现，在体外培养时，TGF－β1可以诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）定向分化为软骨细胞，其Ⅱ型胶原蛋白（Col－Ⅱ）的表达与TGF－β1的剂量呈正相关［4］。在现阶段的软骨组织工程研究中，TGF－β1应用最为广泛，被认为是最重要的软骨诱导因子之一。Glowacki等［5］将人真皮成纤维细胞培养于含1% Nutridoma的DMEM 培养液中，加入TGF－β1和白细胞介素－1α（IL－1α）11 d后，可以观察到4－硫酸黏多糖软骨素显著增多，表明在软骨组织工程细胞培养中可以用TGF－β1和IL－1α替代胎牛血清。

以上研究充分表明，TGF－β尤其是TGF－β1在诱导软骨生长增殖方面起到非常重要的作用。

二、胰岛素样生长因子（IGF）

作为对细胞增殖和调控有着重要影响的一类细胞因子，IGF在细胞分化、增殖以及个体生长发育中的各种作用逐渐被研究者们发现。IGF 和人类前胰岛素肽段有很高的同源性，有IGF－1和IGF－2两种形式。IGF－1是一种单链碱性蛋白，分子量7．7 kD，可以促进软骨细胞DNA的合成、软骨细胞的增殖，并维持其表型的稳定，甚至可以诱导脂肪源性干细胞分化为软骨细胞［6，7］，局部应用IGF－1后，可观察到软骨细胞的凋亡明显减少，损伤软骨的修复明显加快。壳聚糖（chitosan，CS）介导IGF－1局部转染对关节软骨损伤修复作用的实验研究表明：CS／IGF－1复合物对损伤软骨的修复有着明显促进作用，其作用机制在于可增加软骨细胞中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的表达，促进损伤软骨修复［8，9］。

Tian等［10］在小鼠实验中通过逆转录－聚合酶链反应证明了IGF－1可以显著增加软骨低聚物基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）的表达，通过连接胶原纤维中的Ⅱ型和Ⅸ型胶原促进损伤或变性软骨的修复。黄建荣等［11］在体外培养人关节软骨细胞的研究证明IGF－1可促进软骨细胞再生，使体外软骨组织工程的质量得到很大发展。此外，胰岛素被发现能与IGF－1 受体结合，从而表现出与IGF－1相似的效果。最新的研究证实［12］，在牛关节软骨细胞混合培养的多孔支架中添加高生物活性的胰岛素，可明显促进软骨细胞的接种和空间分布，促进细胞增殖。

上述研究表明，IGF 在促进软骨细胞增殖、损伤软骨修复及再生等方面起着重要作用，而与其同源的胰岛素分子也起着与其类似的作用。

三、成纤维细胞生长因子（FGF）

1940年，研究者在大脑和垂体中发现了一种可以促进成纤维细胞增殖的物质，之后在其他很多组织中均有发现。30年后，研究者纯化出该物质，通过测定确定其为一种分子量16～18 kD的蛋白质，命名为FGF。后来，FGF在动物及人类的大脑、垂体、肝、肾、软骨和骨等多种组织中均被检测出来。研究发现，FGF的作用机制是通过与细胞外基质中的肝素黏多糖分子的受体相结合并激活细胞，从而产生相应的效应［13］。成纤维细胞生长因子可有效促进细胞的有丝分裂进程，也可诱导细胞的形态发生以及分化过程，参与细胞生长增殖和组织损伤的修复过程。

FGF可明显抑制幼稚软骨细胞的分化，减少合成碱性磷酸酶，抑制软骨细胞对钙的吸收。徐平等［14］的研究结果显示FGF在肢体发育过程中与软骨增殖、关节发育以及关节内软骨基质的形成和发育有密切的关系。任昌松等［15］的研究提示小剂量的FGF对体外培养的多种细胞都有促进增殖的作用，而持续大剂量使用FGF 对体外培养的骺板软骨细胞表达Col－Ⅱ和Col－Ⅹ产生抑制作用。Barr等［16］通过体外研究，探讨重组人成纤维细胞生长因子18（rhFGF－18）对机械损伤的关节软骨的修复反应的影响。动物模型证明，rhFGF－18明显增加了蛋白聚糖的合成，修复细胞数量，并防止细胞凋亡，这项最新的研究结果表明，rhFGF－18对机械损伤的软骨修复有着重要促进作用。Mori等［17］的最新研究结果显示，rhFGF－18是通过基因表达谱来保护关节软骨，这一效应可能是由基质金属蛋白酶的组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP－1）介导。Shasti等［18］在体外软骨耳廓再造组织工程研究中发现，FGF的主要作用在于增加软骨细胞的数量，而成骨蛋白－1（osteogenic protein－1，OP－1）的作用则是保持软骨细胞的表型。Komura等［19］将FGF缓慢注入新西兰白兔气管腔，证实FGF能显著促进气管软骨的生长，表明FGF 是一种非常有效的诱导软骨细胞增殖的生长因子。

以上研究表明，FGF 对软骨损伤修复及生长方面起重要调节作用，并且与其浓度密切相关。

四、骨形态发生蛋白（BMP）

BMP属于TGF－β超家族中的一个亚群，到目前为止，已经发现有15种之多，与其相关的蛋白则达到40种。BMP在胚胎的形成过程中有着重要的作用，是介导早期发育和器官形成的主要因子。而在运动系统中，BMP有促进软骨、骨和运动系统相关结缔组织发生的作用。现已证实BMP－2、4、6、7和9都具有明显的成骨作用，而BMP－3则对成骨具有抑制作用［20］。Hoffmann等［21］研究发现，BMP介导了四肢与中轴骨骼以及软骨形成的初始阶段。

BMP－7即OP－1，属于骨形态发生蛋白家族，显著特点是骨诱导能力强。Chubinskaya等［22］在各种动物模型软骨修复的体内研究数据显示，OP－1是一种十分独特的生长因子，不同于BMP家族中的其他成员，它具有很强的合成代谢活性和非常突出的抗分解代谢能力。动物研究表明，OP－1具有修复损伤或退化软骨的作用，对软骨缺损及骨关节炎患者具有积极的意义。

Che等［23］把BMP－7基因转染到密度为5×106／mL的兔软骨细胞中，再接种到胶原纤维蛋白凝胶支架，培养14 d。然后，支架被植入到兔膝关节的人造软骨缺陷处（缺损直径为5 mm）。12周后，将兔处死并用改良O’Driscoll软骨评分来评价软骨修复的效果，差异具有统计学意义。转基因疗法可能是一个有前途的治疗方法，但新的治疗方法仍需要长期随访及进一步研究。

最新研究发现，脂肪源性干细胞（adipose－derived stem cells，ASCs）有望用于软骨再生。Lu 等［24］使用杆状病毒（BV）系统，对兔的脂肪源性干细胞进行FLPo／Frt－介导的转基因重组。在多孔支架上添加BMP－6培养2周后，再植入全层关节软骨缺损。12周后进行透明软骨细胞形态、基质成分和机械性能评估，结果表明BMP－6可明显促进透明软骨的再生。

上述结果表明，不同BMP亚型对软骨细胞的刺激作用不一，其中BMP－7和BMP－6对软骨损伤的修复及再生有重要影响。

五、血小板源性生长因子（PDGF）

PDGF是人们在对血小板的研究中偶然发现的，后来，研究者发现这种因子在骨组织中表达，并对骨组织代谢起到重要调节作用。PDGF是骨细胞重要的有丝分裂源，它主要由成骨细胞分泌产生并贮存于骨基质中，对骨的生成和改建有较大的影响。PDGF由两种不同类型的多肽链构成，其作用机制在于它可以结合在受体上并形成二聚体，使酪氨酸蛋白激酶受到激活，从而发生磷酸化。

早在1995年，PDGF 就被证实对骨和软骨细胞有着重要的影响作用，但仅仅是体外研究。Andrew 等［25］通过实验指出，在正常人体的骨折修复当中，PDGF 高度表达。2009年，Tumia等［26］使用不同浓度的PDGF 对羊半月板细胞进行体外培养试验，并用放射性胸苷摄取测定法来评估细胞增殖情况，证明PDGF既刺激了半月板区细胞的增殖也促进了基质的形成。Yuan 等［27］通过实验证实了高压氧和PDGF能显著增强软骨的修复，且促进修复组织的透明软骨再生。

以上研究均表明，PDGF在骨组织的损伤修复过程中起着很重要的作用。

六、软骨源性形态发生蛋白（CDMP）

1994年，Storm 等［28］从小鼠中分离出CDMP。后来人们发现不同种属的CDMP具有高度的同源性，故CDMP 一般不引起排斥反应。正是由于CDMP的低免疫属性，跨种属应用已成为可能，有着广泛的应用前景。同年，Chang等［29］克隆出一种多肽，被命名为CDMP－1。

CDMP包括CDMP－1、CDMP－2 和CDMP－3 三种亚型，无论在结构或生物学特性上，这三者都极为相似，它们参与了软骨组织的发生、生长以及损伤修复的全过程，对软骨细胞的分化调节起到重要作用。其中，人们对CDMP－1的研究最为深入。

CDMP－1主要表达于四肢骨及关节区，是早期软骨化重要的调节因子，可以剂量依赖的方式促进软骨祖细胞的聚集和黏附，在晚期则起到刺激软骨细胞增生和促进其成熟的作用［30］。Spiro 等［31］在SD大鼠的皮下和胫骨后肌植入含rhCDMP－1的Ⅰ型胶原／羟基磷灰石，2周后发现了其碱性磷酸酶的活性与rhCDMP－1的浓度呈正相关，证明CDMP－1可以在体外诱导BMSCs形成软骨样结构。Dines等［32］利用大鼠为实验模型，用rhCDMP－1治疗其损伤的肌腱，结果证实受损肌腱明显肥大，肌腱愈合率较空白组明显增高。

七、肿瘤坏死因子（TNF）

TNF主要由活化的巨噬细胞、自然杀伤细胞和T 淋巴细胞产生。其中，TNF－α由巨噬细胞产生，是一种骨性关节炎促炎细胞因子，通过上调MMP 基因表达，抑制蛋白多糖及胶原的合成，最终导致了软骨基质的降解。Sakai等［33］证明，TNF－α和环氧化酶（COX）－2 共同参与软骨基质降解和相关炎性反应，最终导致软骨溶解。但是到目前为止，其细胞内信号的传导途径以及导致软骨溶解的机制尚未有进一步的研究进展。

Criscione等［34］证实，TNF－α拮抗剂是一种最有价值的抗风湿药。依那西普（可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ）和英夫利昔单抗（抗TNF－α单克隆抗体的嵌合体）在治疗类风湿关节炎（RA）的临床试验中证明了其显著的治疗效果。其作用机制可能是，机体过量产生TNF－α促进滑膜的炎症和增殖，以及关节软骨和骨的降解，而TNF－α拮抗剂可有效地降低滑膜的炎症并抑制软骨和骨的退化［35］。IL－1 和TNF－α协同作用，关节软骨细胞中的一氧化氮合酶被激活，从而抑制蛋白多糖和胶原的合成，最终诱导软骨细胞的凋亡［36］。

综上所述，TGF－β、IGF、FGF、BMP、PDGF、CDMP 和TNF在软骨细胞的发育、生长、增殖、分化、代谢以及凋亡等各个方面相互协调、互相作用。损伤软骨的修复是一个极其困难与复杂的过程，而软骨组织工程技术的发展，可以极大地促进人体软骨的修复，具有广阔的应用前景。软骨的修复过程是由多种细胞因子之间共同作用的结果。过去研究者们对单一细胞因子的作用较为重视，而往往忽略了不同细胞因子之间的复合作用，不同因子之间的组合往往可以表现出更强的协同或者拮抗效应。再者，各种因子的信号传导途径以及量效关系也需要更深入的探索。此外，当细胞因子在体内起效应时是否对其他组织也有影响，甚至是有害的影响，其临床安全性也有待人们去进一步发掘。

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