应用纳米技术和纳米材料医疗器械评价的相关问题

陈宽

纳米技术的出现和发展，对于医疗器械技术的进步具有极为重大的意义。纳米技术为人类提供了在纳米尺度上对材料进行加工和制造的手段，纳米物质具有许多独特的性质，如高比表面积、可控的亲水/疏水性质、多功能性、主动/被动靶向、尺寸排阻等，在新型药物投送系统、体外诊断试剂、植入物和组织工程产品中均具有广阔的应用前景。与同样化学组成的传统物质相比，纳米物质可以通过多种方式进入人体，如吸入，根据尺寸和形状的不同，吸入的纳米物质可能沉积在呼吸道和肺组织中，并可以经由肺上皮细胞进入血液并到达远端组织［1］。某些纳米物质，如纳米二氧化锰，可以通过嗅神经进入脑组织［2］。而这一方式是传统物质所无法实现的。为了实现对使用纳米技术或包含纳米材料的医疗器械进行有效监管，首先应做到正确识别产品生产过程是否使用了纳米技术或纳米材料。FDA在其指导原则中［3］，强调其监管产品范围中对是否应用纳米技术的考虑:(1)所含材料是否在纳米尺度(1～100 nm);(2)所含材料是否具有依赖尺寸的物理、化学，或者生物性质，甚至可以超出纳米尺度范畴，上限可达1 000 nm。除尺寸依赖的性质外，FDA还强调了“人造”材料，即将那些天然形成的以及无意之间偶然产生的，尺寸在纳米尺度的物质排除在外。

1 应用纳米材料的医疗器械技术监管中遇到的问题及研究进展

1.1 纳米材料的鉴别和表征 目前，由于不断有研究工作揭示出与纳米材料相关的风险。企业为规避监管，可能不会宣称其产品使用了纳米材料或者在产品的生产过程中应用了纳米技术。因为国家食品药品监督管理总局早在2006年就将纳米产品从Ⅱ类升级为Ⅲ类，并对其安全性和有效性进行审慎的考察。因此，企业并不以纳米技术作为其产品的主要宣传点，在这类情况中，由于纳米物质具有某些优异性能，或者在生产工艺中需要采用纳米技术，从而可能产生一批没有贴纳米标签的，实质上的纳米产品。

对于此类产品，在技术审评工作中，首先要求审评人员具备一定的专业知识，能够从企业递交的注册资料中准确判断产品中是否有纳米物质成分，或者在生产中采用了纳米技术。为了准确鉴别医疗器械中是否使用了纳米材料，证明等同性非常重要。化学成分的相似性并不足以证明纳米材料的等同性，因为纳米材料是否呈现出特定性质可能取决于纳米材料的化学成分和形状，和(或)纳米材料的来源(供货方)。当判定了产品确实是纳米产品之后，对于其安全性和有效性的把握，需要具备必要的纳米表征手段知识。对含有纳米材料的医疗器械的生物学效应的试验和评价要求对纳米材料进行全面表征。因为纳米材料的毒性，不仅取决于其化学成分，也与其粒度(粒度分布)、长径比、形状、表面形貌、表面电势、表面化学、亲水(疏水性)、团聚(聚集)态等因素密切相关［4-11］。因此，对于某些产品，可能需要根据扫描电镜、透射电镜、原子力显微镜、电感耦合等离子质谱等表征手段所获得的图像和数据来判断其安全性和有效性。

应该根据纳米材料的类型和形式，以及器械的预期用途来选取表征方法。对特定物理化学参数的表征通常可采取多种方法。单一的表征方法可能无法提供对于参数的准确评估(例如:粒度分布、表面成分)。在该类情况下，如果可行，可能需要采取补充方法来对需要表征的性质进行充分评估，即采用两种独立的表征方法。需要特别注意的是，用不同的方法获取的有关特定性质的结果不能直接进行对比。例如，正如指导性文件［12，13］所指出的，对于粒径测定，应至少采用两种显微镜技术(例如:透射电镜和激光扫描共聚焦显微镜)。

为了对使用纳米技术的医疗器械进行可靠的表征，需要毒理学、物理学、化学、工程学和其他专业领域的专家之间的跨专业合作。

1.2 纳米材料剂量 用于毒理学研究的剂量水平通常是以质量浓度为基础。然而，纳米材料的多个属性可能会影响其毒理性质。普遍认为，除了质量浓度以外，还应使用包括表面积和数量浓度在内的其他参数来充分表征纳米材料剂量。

在确定用于纳米材料体外研究的毒理学相关的剂量时，应该考虑可分沉淀物的可能性［14-16］。小纳米颗粒(例如:水动力学直径＜40 nm)与培养细胞层之间的接触主要取决于扩散和对流力。由于沉降力的额外影响，在细胞培养基中形成的稍大的纳米材料和纳米材料聚集体的沉淀速度更快。这些因素，以及与蛋白质和培养基其他成分的相互作用，可能会影响直接接触培养细胞的颗粒的数量。

应该根据具体情况评价可分沉淀物出现的可能性。若有必要，应开展对于体外细胞剂量的分析性或计算性评估［15，16］。目前，对介质中的剂量(分散/溶液浓度)或实际的纳米颗粒细胞摄入/接触量是否应该被用于剂量本身的表达还存在争议。

1.3 纳米材料参照样品 试验结果的可靠性在一定程度上取决于是否可获得适合的参照样品。参照样品指拥有一项或多项特性参数、具有足够可重复性的已经确认的材料。可利用该材料或物质对仪器进行校准，评估测量方法或为材料赋值。

纳米尺度参照样品的最初研发重点在于将其用于校准试验仪器，而不是作为生物响应基准进行参照样品研发。开发一种广泛接受的参照样品，包括在适合不同的试验系统的阳性对照与阴性对照纳米颗粒方面达成共识，已经成为纳米材料风险评估的一个关键性要求［17］。虽然参照样品对于评估医疗器械中应用的纳米材料至关重要，但是因为存在实际困难，研发进度还是很慢。

认识到纳米材料代表性样本的可用性对于纳米物质安全试验的可重复性和可靠性至关重要。ISO/TC 229 nm技术委员会已提出使用“代表性试验材料”，并且正对其进行讨论。代表性试验材料的拟议定义为“来自同一批的物质，在其一个或多个特定性质方面具有同质性和稳定性，被认为适合于开发用于针对除已表现出的同质性和稳定性以外的性质的试验方法［18］”。目前这种方法已被应用于OECD人造纳米材料工作组的纳米材料安全性试验合作项目，该项目使用欧洲委员会联合研究中心代表性纳米材料库中的代表性纳米材料来进行。

1.4 纳米材料样品制备 纳米材料体积小，并且其物理化学特性可能发生改变，这使得与宏观(非纳米尺度)颗粒或化学物质的试验相比，纳米材料的样品制备会遇到重大的挑战。带来挑战的因素包括能加强纳米材料反应性的表面性质;聚集或团聚颗粒的形成;纳米颗粒在通过水合作用，部分溶解或其他过程的分散中发生的转变;以及低浓度水平污染物对纳米材料的物理化学性质和毒理性质的强烈潜在影响。如同其他类型的试验样品，纳米物体有可能吸附到容器表面。因此，确认标称浓度非常重要。

对于研发针对含有纳米材料的医疗器械的可靠的样品制备方案来说，必须认识到这些问题。相比于使用常规材料的医疗器械，解决这些问题也许需要极大提高直接针对样品制备的研发力度，并制定处理策略。

由于其独特的表面性质，纳米材料对用于样品制备的技术表现出极强的敏感性。颗粒之间以及颗粒与周围环境之间的相互作用会影响颗粒的分散。分散的纳米材料不一定呈现单分散颗粒的形式。呈聚集形式的单分散颗粒(由强结合或强融合的颗粒组成的颗粒)和呈团聚形式的非单分散颗粒(弱结合颗粒，聚集体，或两者的混合体)可以出现在以液体、粉末和气溶胶形式出现的纳米材料中，除非通过表面电荷或立体效应进行稳定化处理。因此，样品中纳米材料的分散状态和粒度分布可能随时间变化。这一属性对于制备浸提液和(或)储存溶液和剂量分散溶液有着非常重要的意义，pH值、离子强度或分子成分的轻微调整就可能显著改变颗粒分散度。基于该原因，受试品的稳定性对于在生物评价中获取具有代表性的和可重复性的结果来说显得尤为重要。

纳米材料的样品制备可能包含对于制造商生产的或供应商提供的材料的表征，以及制备用于动物试验或体外实验的储存溶液和剂量溶液。制备细节可能根据给药途径和递送方法的不同而有所差别。

1.5 纳米材料对于生物相容性研究试验的影响 将纳米材料用于试验系统时，必须认识到需要测定的一些性质可能会受到周围环境的影响，并且在很大程度上依赖于周围环境(例如:组织培养基、血液/血清、蛋白质存在)。与环境的相互作用可能导致纳米材料本身发生暂时性改变，如通过获得/脱落蛋白涂层，形成纳米颗粒团聚/聚集，或纳米材料其它方面的变化。由于这样的变化可能会影响纳米材料的特性，因此会影响纳米材料的毒性特征。因此，纳米材料应完全根据制造出来的形态/组成，以及最终用户所接收的形式(如果该形式包含自由纳米材料)进行表征。最后，还应该对最终产品中的纳米材料进行评价。对于生物安全性评价，需要将纳米材料分散在适当的介质中进行评价。这些介质与纳米材料之间的相互作用可严重影响到纳米材料在试验系统中的表现。应该在试验过程和试验结果评价过程中考虑该因素。

纳米物体在生物环境中很容易将蛋白质迅速吸附在其表面，形成所谓的蛋白质“冕晕”。据报道，冕晕是由两层结构组成，内层是由强结合的蛋白质组成，而外层是由快速交换的分子组成［19］。蛋白质冕晕并不是静态的，可能根据纳米材料所处环境的不同而发生改变。

作为有机体内的异物，纳米材料的归宿为从被吸收、分布、代谢到排泄/消除。众所周知，纳米材料表现出与其对应的常规材料不同的物理化学特性(力学、化学、磁学、光学或电学特性)，因此，可以合理的期望纳米尺度材料会影响生物学行为，并且生物学行为会引发在细胞、亚细胞和生物分子层面(例如:基因和蛋白质)包括细胞摄取的各种不同反应。因此，与由常规材料引发的毒理学反应所不同的各种毒理学反应可能在接触到纳米材料后才会显现。应该注意的是，不仅蛋白质会以冕晕形式参与这个过程，而且脂质也会参与这个过程［20］。

因此，毒物动力学研究应被视作针对含有纳米材料的医疗器械开展的毒理学风险评估的一个部分。

当接触到生物环境的时候，纳米材料会与蛋白质发生相互作用，这种相互作用的定量和定性水平取决于生理环境的性质(例如，血液、血浆、细胞质等)和纳米材料的特性。同样，当接触到试验介质的时候，纳米材料也会与周围环境发生相互作用并且/或者也会对环境产生干扰，这取决于其本身的性质和所接触的条件;跟相应的常规材料相比，它们可能会有不同的表现。因此，对于任何被设计用来对医疗器械进行生物学评价的试验方法，对其进行专门的验证是十分有必要的。试验方法的选择将取决于纳米材料的特性。

在纳米材料的毒性试验中，有几个已知的风险因素应该避免。对纳米材料的毒性和最终结局了解的还不多，所以一些未知的隐患还会在将来逐渐显露出来。由于纳米材料的毒性试验存在许多不确定性，所以公开透明变得至关重要。

潜在的生物相互作用不是直接取决于分子的浓度或数量，而是取决于纳米颗粒本身。在纳米毒理学中，剂量反应关系的单位可能不是传统意义的质量单位，而可能是以纳米颗粒的数量或者他们的总表面积来表示剂量。除了表征以外，还应该以文件的形式记录下实验条件的详细情况。

2 纳米材料标准化工作

对于医疗器械技术审评工作而言，国家标准和行业标准就是准绳和依据。做好采用纳米技术或包含纳米物质产品的技术审评工作，标准同样十分重要。然而，当前国际上纳米技术标准的制定工作也只是处于起步阶段，我国是全世界最早开始从国家层面制定纳米技术标准的，但也仅仅是从2003年全国纳米技术标准化委员会成立才开始［21］。国际上，ISO纳米技术委员会TC 229于2005年成立［21］，并自2006年起开始制定针对纳米材料内毒素的测量标准的国际标准ISO 29701［22］。美国材料测试协会ASTM也于同年成立了E 56纳米技术委员会，并相继制定出了E 2524-08《纳米颗粒溶血性质分析的标准测试方法》，E 2525-08《评估纳米颗粒材料对小鼠粒细胞-巨噬细胞集落形成影响的标准测试方法》以及E 2526-08《评估纳米颗粒材料在猪肾细胞和人肝癌细胞中的细胞毒性的标准测试方法》。ISO TC194的第17工作组也为ISO 10993系列标准制定了第22部分，即《医疗器械的生物学评价-纳米技术》。

以上这些标准制定工作为我们开展针对采用纳米技术的医疗器械产品的审评工作提供了参考，但更多的工作需要审评人员与来自各个学科的专家密切合作。纳米产品种类繁多，不可能有一个单一的评价标准。还要我们在今后的审评工作中多总结，从中提炼出审评要点，并进而形成指导原则，与专家们一道把握好纳米技术医疗器械的审评工作。

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