靶向表皮生长因子受体分子探针研究进展

林潇 唐明灯

靶向表皮生长因子受体分子探针研究进展

林潇 唐明灯

许多恶性肿瘤细胞的增殖、转移以及不良的预后已被证实与表皮生长因子受体（EGFR）的过度表达相关。目前，针对这个靶点，美国食品和药物管理局已经批准了多个靶向EGFR药物，如吉非替尼、厄洛替尼，但治疗效率总体偏低。核医学显像能够在分子水平上评价EGFR的表达水平及其突变程度，从而为临床个性化治疗提供有力依据。笔者简述靶向EGFR分子探针及其存在的缺点，以期为进一步研究提供帮助。

表皮生长因子受体；体层摄影术，发射型计算机，单光子；正电子发射断层显像术；分子探针

癌症严重危害人类健康，根据美国癌症协会2013年统计报告公布，目前全世界范围内每死亡8人，其中就有1人死于癌症。在2008年，全世界约有1270万人被诊断出患有癌症，约760万人死亡。预计到2030年，新发癌症患者将达到2130万人，将有1310万人死亡。

癌症的传统治疗手段主要包括手术、放疗和化疗，这些方法虽然已大幅度改善肿瘤的治疗效果，但仍存在不良反应、缺乏特异性、容易对正常组织产生损伤等缺点。因此，仍需要寻找更有效的治疗方法来改善治疗效果。

随着肿瘤生物学的发展，有研究发现，某些基因的过度表达或突变会对肿瘤的生物学性质以及治疗效果有显著影响，提出通过阻断这些基因来控制和治疗肿瘤，这就是分子靶向治疗[1]。即针对不同的靶点，选择不同的靶向药物进行特异性地治疗。其中，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）在实体瘤中的过度表达与肿瘤发展及转移密切相关[2－3]。然而，采用EGFR进行分子靶向治疗能够取得良好疗效的患者比例并不高。临床实验显示，Erlotinib和Gefitinib治疗非小细胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC）仅对10%～15%的患者有效[4]。卵巢癌、头颈癌、食道癌、宫颈癌、膀胱癌、乳癌、结直肠癌、胃癌和子宫内膜癌的不良预后均与EGFR的过度表达以及突变状态相关[5]。可见在靶向治疗前，对患者进行EGFR表达水平的评估十分必要。目前，临床上用于检测EGFR表达水平的方法主要有活检和血清学检测[6]，但都存在一定的缺陷。相比之下，核医学显像能够无创地对肿瘤进行分子水平上的评价，其灵敏度高，可重复性强，能为临床治疗提供十分有利的依据。目前，检测EGFR的药物主要分为2类：单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂[7]。

1 单克隆抗体类

1.1 单光子核素标记类

EGF是由53个氨基酸组成的蛋白，Reilly等[8]采用111In直接对EGF进行标记，在hEGF上引入DTPA，制得111In-DTPA-hEGF，标记时间约为15 min，约70%的111In-DTPA-hEGF与人乳腺癌MDA-MB-468细胞特异性结合。

Reilly等[9]同样采用111In标记DTPA连接的抗EGFR的单克隆抗体Mab 528，与111In-DTPA-hEGF在荷人乳腺癌MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、JW-97细胞的无胸腺小鼠体内进行对比发现，111In-DTPA-Mab528（21.6%ID/g）的肿瘤摄取值是111In-DTPA-hEGF（2.2%ID/g）的10倍。并且对荷MDA-MB-468以及JW-97肿瘤的小鼠显像发现，111In-DTPA-Mab528对肿瘤的探测效果更好。

Jung等[10]将EGF和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）生物素分子相连，再分别连接99Tcm-肼基尼古酰胺（hydrazino nicotinamide，HYNIC）标记的avidin-FITC（Av）和streptavidin-Cy5.5（Sav）。99Tcm-Av-EGF和99Tcm-Sav-EGF两个探针在体外与靶细胞特异性结合，但在体内的药代动力学和生物学分布则各不相同。99Tcm-Av-EGF在体内快速代谢（T1/2= 4.3 min），在肝中摄取高而肿瘤摄取低（4 h：0.6% ID/gm）。99Tcm-Sav-EGF在体内代谢时间较长（T1/2= 51.5 min），非特异性摄取低，肿瘤摄取相对较高（3.8%ID/gm）。Jung等[11]将EGF和99Tcm-HYNIC用PEG链相连，再连接在链霉亲和素包裹的量子点上。探针99Tcm-HYNIC-EGF-PEG-Qdot表现出对EGFR的高亲和力。静脉注射后，无论是光学成像还是放射性扫描成像，都能清晰地探测到MDAMB-468肿瘤。另外，对MDA-MB-468肿瘤的系列成像发现，随着西妥昔单抗（Cetuximab，C225）治疗的进行，EGFR表达降低，而肿瘤摄取也成比例地显著降低。量子点的最大缺点是纳米颗粒的不良作用还不甚明确。

西妥昔单抗是人/鼠嵌合型免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）单克隆抗体，它可以高亲和力地与EGFR结合，从而阻碍内源性配体与EGFR的结合，阻断EGFR激活，从而阻断EGFR依赖的肿瘤细胞增殖、转移、侵袭以及血管生成等生物学效应，还可引起受体的二聚化、内化和下调[12]。Schechter等[13]使用乙二半胱氨酸（ethylenedicysteine，EC）作为双功能连接剂，制备得到99Tcm-ECC225。体内分布实验显示，肿瘤靶与非靶比值随时间增加。

基于EGFR的免疫治疗特异性抗体，如帕尼单抗（panitumumab）和西妥昔单抗，均表现出优良的临床前景。但是越来越多的研究表明，仅有部分患者能够从中得益，并且在有治疗效果的患者中也会产生抗药性。因此，Liu等[14]将panitumumab和cetuximab单抗与1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四羧酸（1，4，7，10-tetraazcy clododecane-N, N′，N，N′-tetraacetic acid，DOTA）相连，再用177Lu进行标记，得到177Lu-DOTA-panitumumab（177Lu-Pan）和177Lu-DOTA-cetuximab（177Lu-Cet）。在UMSCC-22B肿瘤模型小鼠中进行的SPECT/CT显像和生物分布实验显示，二种显像剂都有不错的肿瘤靶向性。177Lu-Pan的肿瘤摄取值更高[（24 h：20.92± 4.45）%ID/g]，生物免疫实验也显示其抑制肿瘤生长的效果更加明显。

单抗应用于显像诊断普遍存在一些缺点，如半衰期较长、渗透性差和鼠源免疫性等。与之相比，人或是人源化的抗体片段可能更适合进行成像诊断。Xu等[15]和Wang等[16]对已有的抗体片段Fab进行125I标记，在EGFR表达水平递减的3种肿瘤（人皮肤鳞癌A431细胞、人胶质瘤U118细胞和人黑色素瘤M14细胞）模型小鼠中进行评价，结果发现，注射后1 h，A431肿瘤摄取十分显著，U118肿瘤也清楚可辨。而M14肿瘤中的摄取在4 h之内迅速地降低；在注射后9 h，A431和U118肿瘤中的摄取愈发显著，而M14肿瘤中的摄取值已趋于本底。比较T/N值，A431随时间不断增加，注射后48 h达到峰值（约为15）；U118也随时间增加，注射后15 h达到峰值（约为7）；M14肿瘤则无明显变化。因此，研究认为，125I-Fab有望区分EGFR的表达水平。

1.2 正电子核素标记类

在NSCLC中，40.3%的EGFR基因突变是由外显子21突变引起，并且94.4%的突变是第858位密码子发生了碱基（T→G）突变，从而使该位点的氨基酸由亮氨酸变为精氨酸。这个过程称为L858R[17]。另有研究发现，部分NSCLC患者在使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治疗10个月后出现耐药性，此结果与EGFR基因20号外显子T790M基因突变有关。

Pal等[18]合成制备了4-[（3-iodophenyl）amino]-7-{2-[2-{2-（2-[2-{2-（[18F]fluoroethoxy）-ethoxy}-ethoxy] -ethoxy）-ethoxy}-ethoxy]}-quinazoline-6-yl-acrylamide（[18F]F-PEG6-IPQA），体外实验发现，该探针选择性地浓聚于表达L858R型突变的EGFR的NSCLC细胞上，PET显像能够区分对EGFR TKI治疗敏感的L858R型突变的NSCLC与表达野生型EGFR的NSCLC。Yeh等[19]则发现，与野生型以及T790M基因突变型EGFR相比，[18F]F-PEG6-IPQA能够选择性地与L858R基因突变的EGFR激酶相结合。

Pal等[20]体外实验显示，morpholino-[124I]-IPQA在A431细胞以及经过基因改造而表达EGFRⅧ的U87细胞中快速聚集并滞留良好，而在野生型EGFR的U87MG细胞中的表达则恰恰相反。同时，morpholino-[124I]-IPQA通过PET显像能够得到A431皮下肿瘤的EGFR活性，而对于人慢性粒细胞白血病K562细胞发展而来的皮下肿瘤则结果相反。因此，该研究认为，morpholino-[124I]-IPQA能够探测EGFR酶信号活性高的肿瘤，包括EGFRⅧ突变的脑肿瘤和表达功能获得型EGFR酶突变的NSCLC。但不足的是，该显像剂由肝胆肠道排泄，肠道显影较高，影响该部位肿瘤的判断。

Cetuximab是第一个被美国食品和药物管理局批准用于转移性结直肠癌治疗的EGFR特异性的单抗，目前也应用于其他实体瘤的治疗[21]。Cai等[22]将西妥昔单抗与DOTA相连，用64Cu进行标记，制备得到64Cu-DOTA-Cetuximab，并在7种肿瘤模型中进行测定，通过MicroPET显像发现，64Cu-DOTA-Cetuximab在EGFR高表达的肿瘤细胞中摄取高，而EGFR低表达的肿瘤中摄取相对较低。摄取值与EGFR表达水平（用western blotting测量）有良好相关性。Sadri等[23]在荷人乳腺癌MDA-MB-468肿瘤的裸鼠中对64Cu-DOTA-Cetuximab进行评价发现，肿瘤摄取值高，在注射后4 h肿瘤摄取值为（11.65±3.89）%ID/g；24 h可达到（20.91±2.49）%ID/g。另有研究发现，64Cu-DOTA-Cetuximab在荷人宫颈癌细胞（Caski）裸鼠中有相对较高的肿瘤摄取，但在血液和肝脏中的摄取值也比较高[24]。Niu等[25]在头颈部鳞状细胞癌中的研究结论却不相同，UMSCC-22B细胞的EGFR表达水平低于鳞状细胞癌（SCC1）细胞，然而，UM-SCC-22B细胞中的64Cu-DOTA-Cetuximab却高于SCC1细胞。89Zr-Cetuximab是通过琥珀去铁胺B（succinylated desferrioxamine B，N-sucDf）进行标记得到的[26]。Aerts等[27]对其评价发现，测量得到的EGFR水平和PET检测到的信号并不成比例。EGFR表达水平处于中位的细胞株的肿瘤/血液比值显著高于EGFR表达水平最高的细胞株。正常组织中的摄取则没有太大区别。抗体的摄取和EGFR表达水平直接存在差异，提示药代动力学和药效对肿瘤治疗存在的影响不容忽视。

Miao等[28]用N-[2-（4-18F-fluorobenzamido）ethyl] maleimide（18F-FBEM）和affibody类似物Ac-Cys-ZEGFR：1907耦合，制得探针18F-FBEM-Ac-Cys-ZEGFR：1907，结果显示，该探针与A431细胞的亲和力为37nmol/L，在肿瘤中快速摄取及聚集，注射后3 h除了肝和肾以外的其余脏器均已清除，因此有很好的肿瘤靶与非靶比值。在A431肿瘤模型中，18F-FBEM-Ac-Cys-ZEGFR：1907探针与45 μg Ac-Cys-ZEGFR：1907共同注射，能够提高肿瘤的摄取值；而在显像时与500 μg Ac-Cys-ZEGFR：1907共同注射，能够显著抑制肿瘤的摄取。

2 小分子TK1

在小分子EGFR-TK1方面，应用最广泛的是4-氨基喹唑啉类衍生物。

2.1 正电子核素标记类

1999年，Fredriksson等[29]报道合成了11CPD153035，并在荷神经细胞瘤的小鼠体内进行了生物评价。Meng等[30]对21例患者进行了11CPD153035的临床研究，认为其可用于检测NSCLC患者对EGFR-TK1的响应情况，但不适合用于检测靶向治疗的效果。

吉非替尼（Gefitinib，ZD1839，Iressa）和厄洛替尼Erlotinib（OSI-774，Tarceva）是美国食品和药物管理局已批准的两个选择性EGFR-TK1，用于晚期或转移性NSCLC的治疗，目前这两种药物也处于其他类型肿瘤的临床试验中。2009年Memon等[31]报道合成了11C-Erlotinib，并在荷肺癌模型小鼠中进行了microPET显像。Memon等[32]对13例将进行erlotinib治疗的NSCLC患者预先进行了11C-Erlotinib显像，并与18F-FDG进行了对比，结果发现，11C-Erlotinib在4例患者体内的一处或多处肺癌或淋巴转移部位浓聚，而18F-FDG PET/CT则不能发现病灶。其中，除1例患者死亡之外，其余3例患者在erlotinib治疗后均有一定的病情改善。2006年，Holt等[33]用11C标记Gefitinib，得到11CGefitinib。Zhang等[34]在荷NFSa肿瘤的小鼠体内进行生物分布实验显示，11C-Gefitinib特异性地浓聚于肿瘤，肿瘤/血液以及肿瘤/肌肉的比值随时间逐渐增高，0～60 min分别由0.4和0.6升高为6.0和5.0。Murali和Flores[35]和Seimbille等[36]都采用18F对4位上的F原子进行取代，成功制得18F-Gefitinib，与11C-Gefitinib标记方法类似，并没有改变Gefitinib的结构。然而，18F-Gefitinib在体内和体外均未表现出与EGFR表达水平或功能水平相关[37]。

在可逆抑制剂中，18F-ML01[38]由于细胞中的ATP浓度高，使得其在肿瘤细胞中被快速排出，从而不能作为合格的显像剂。在不可逆抑制剂中，11C-ML03[39]由于喹唑啉环上的丙烯酰胺基团的不饱和性，从而在体内代谢快，生物利用度低，在肿瘤中的摄取值不高。因此，研究人员选择稳定性好的水溶性化合物[40]进行11C标记，得到11C-ML04[41]。鉴于11C的半衰期较短（T1/2=20.39 min），Dissoki等[42]用18F（T1/2=109.8 min）对其进行标记，得到18F-ML04。18F-ML04需要六步放射合成，合成时间为4 h。在荷人胶质瘤细胞的小鼠中进行的生物分布实验显示，靶与非靶比值在注射后3 h达到最高，肿瘤/血液和肿瘤/肌肉的值分别约为7和5。然而无论是使用EGFR低表达的U138MG肿瘤或是使用非放射性的ML04进行抑制，都只有小部分的特异性摄取[43]。Shaul等[44]用不同的支链取代ML03中的丙烯酰胺基团，在苯胺环上进行124I标记，制得3种标记物：124I-ML06、124I-ML07和124I-ML08，其中124I-ML06和124I-ML08都是不可逆的抑制剂，而124IML07是部分不可逆抑制剂。

阿法替尼（Afatinib，BIBW 2992）是一种不可逆的ErbB家族的阻断剂，能够抑制EGFR、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）以及ErbB4的酶活性[45]。2013年，阿法替尼经美国食品与药物管理局核准上市，用于治疗EGFR突变的NSCLC患者。Slobbe等[46]用18F对Afatinib进行标记，得到标记物18F-Afatinib，并在荷A549和人肝癌HCC827两种肿瘤细胞小鼠中进行生物分布实验，结果表明，这两种肿瘤在5 min时摄取值达到最高并且滞留良好，摄取值保持在1%ID/g左右。非靶器官清除较快，肿瘤/血液值在注射后120 min分别为2.26（A549）和2.59（HCC827）；肿瘤/肌肉值在注射后120 min分别为6.37（A549）和3.83（HCC827）。

2.2 单光子核素标记类

Fernandes等[47]在Gefitinib的结构上进行修饰，在喹唑啉环的C6位置上连上溴代的丙酰胺，用125I标记，得到标记物125I-N-{4-[（3-chloro-4-fluorophenyl）amino]quinazoline-6-yl}-3-iodopropionamide。体外实验表明，非放射性化合物能抑制A431细胞的生长和EGFR的磷酸化。然而，在体内却表现出快速地脱碘现象。研究认为，这是由于脂肪链上的C-I键稳定性差所导致的，如果能够将碘标记在苯环上，就能够提高其稳定性。在C6上改用苯甲酰胺，将125I分别标记在对位和间位上，得到的标记物稳定性好，在A431细胞中摄取值高，在正常小鼠体内生物分布显示，其血液清除快且主要通过肝胆进行代谢[48]。

Bourkoula等[49]将6-氨基-4-（3-溴苯）氨基喹唑啉与吡啶甲醛反应生产亚胺，用“4+1”的策略与[M（CO）3]+（M=99Tcm和Re）连接，形成稳定的配合物。在健康小鼠中，注射后1～15 min，配合物在血液和软组织中快速清除，注射后15～180 min，清除速度减缓。

Hirata等[50]用125I标记PD153035的类似物m-IPQ，得到125I-m-IPQ。该探针对EGFR-TK抑制能力强，其在非靶组织中清除快，但在胃中有摄取，表明其不够稳定，有脱碘现象。为了改善其稳定性，该研究者设计合成了PHY和BAY两个化合物，二者同样也有高抑制力（IC50值分别为：12.7± 7.2 nmol/L和51.0±8.9 nmol/L），且在胃中的摄取低，表明相比125I-m-IPQ，稳定性有所改善。其中125I-PHY的靶/非靶值相对较高，肿瘤/血液和肿瘤/肌肉的值分别为0.94～1.50和1.02～1.95[51]。为了进一步提高靶/非靶值，该研究者对PHY的结构进行修饰，在喹唑啉环的6位上引入6种不同的支链。其中6-（3-Morpholinopropoxy）-7-ethoxy-4-（3’-iodophenoxy）quinazoline（125I-PYK）表现出高肿瘤摄取（1 h：4.37±0.65）并且滞留性能良好（24 h：1.53± 0.15）。同时，在非靶组织中清除较快，因此肿瘤/血液和肿瘤/肌肉的值均随时间不断增加，到24 h时，能分别达到57.0和45.5[52]。

在小分子TKI方面，放射性核素标记的不可逆型EGFR激酶抑制剂与可逆型相比，表现出更好的显像能力。在进行结构修饰时，需要考虑脂溶性对生物性能的影响：降低脂溶性会降低肝胆摄取，但同时可能会降低其细胞穿透力从而降低EGFR激酶结合力；而脂溶性配体如果亲和力过高又会使得探针运输取代受体结合成为决速步，因此，该探针更多反映的是局部血流的差异而不是受体结合位点的差异。另外，目前已有的探针在体外都表现出不错的性能，但在体内的显像效果却并不如预期，一种可能的解释是靶向药物是通过口服给药，而靶向显像药物则是通过静脉注射给药[53]。

3 小结

分子靶向治疗是肿瘤治疗的热点与方向，其中，EGFR靶向治疗在诸多肿瘤治疗中起到重要作用。然而，EGFR靶向治疗成效与肿瘤EGFR的表达以及突变情况有很大关系。PET/SPECT能够在分子水平上提供肿瘤内EGFR的表达和突变水平，且具有无创特性和可重复性，因此能够为临床治疗提供有力依据。目前已有诸多的PET/SPECT EGFR靶向探针，有的已经在临床试验上取得不错的效果，在未来，将有很多性能优异的靶向探针不断涌现出来，使EGFR分子成像转化到临床成为可能。

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Research progresses on molecular probes targeting epidermal growth factor receptor

Lin Xiao, Tang Mingdeng.Department of Nuclear Medicine,Fujian Provincial Cancer Hospital,Fuzhou 350014, China

Tang Mingdeng,Email：tmd0603@126.com

Overexpression of epidermal growth factor receptor（EGFR）has been confirmed to be associated with cell malignancy，metastasis and poor prognosis.Against this target,several drugs have been approvaled,such as gefitinib and erlotinib.However,the therapeutic effect was not satisfied.PET/ SPECT imaging can evaluate the expression and mutation of EGFR at molecular level to provide the basis for individual treat.This article is an overview of the progress of PET/SPECT molecular probes targeting EGFR and related problems in order to provide help for further research.

Epidermal growth factor receptor;Tomography,emission-computed,single-photon; Positron emission tomography;Molecular probes

2014-11-10）

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2015.01.018

350014福州，福建省肿瘤医院核医学科

唐明灯（Email：tmd0603@126.com）